SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用及检测试剂和方法技术

本发明专利技术属于细胞检测技术领域，涉及SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用及检测试剂盒方法。本发明专利技术提供了SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用。SYTOX染色用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞，灵敏度高、准确性高且一致性高，高效、简易且易推广。简易且易推广。简易且易推广。

【技术实现步骤摘要】
SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用及检测试剂和方法


[0001]本专利技术属于细胞检测
，具体涉及SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用及检测试剂盒方法。

技术介绍

[0002]网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的阶段，晚幼红细胞在骨髓脱核形成网织红细胞，网织红细胞进入外周后，进一步清除胞质内的核糖体、线粒体等变成成熟红细胞。目前常用的评估外周血红细胞成熟度的方法主要有以下三种：(1)人工镜检法：利用吉姆萨、新亚基蓝、煌焦油蓝等染液对血液涂片进行染色，然后在显微镜下观察计数网织红细胞、有核红细胞等红系前体细胞，操作繁琐、计数效率低；(2)流式细胞技术：流式血细胞自动分析仪利用噻唑橙等荧光染料与网织红细胞RNA结合原理以及细胞大小来区分不同成熟度红细胞，常见于大型医院检验科，自动化程度高，但由于网织红细胞中的RNA呈网状或团状分布，与荧光染料结合之后，荧光信号散在分布，细胞通过检测器时，根据荧光信号较难区分出单个细胞，且重复检测容易导致样本之间的交叉污染，不适合广泛使用；(3)普通实验室多利用CD71、CD44等红细胞表面分子染色来区分红细胞成熟度，成本较高。本方法提供了一种利用DNA染料SYTOX来区分红细胞成熟度的方法，相较于人工镜检法效率更高；相较于临床常用的流式血细胞自动分析仪法操作更简便成本更低，相较于常规的CD71或者CD44染色更加经济。因此找到效率更高、易普及的检测方法至关重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用及检测试剂盒方法。SYTOX染色用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞，灵敏度高、准确性高且一致性高，高效、简易且易推广。
[0004]本专利技术提供了SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用。
[0005]本专利技术还提供了一种检测外周血红细胞成熟度的试剂，所述试剂包括SYTOX和红细胞抗体。
[0006]优选的是，所述红细胞抗体包括Ter119或CD235a。
[0007]本专利技术还提供了一种非诊断目的的检测外周血红细胞成熟度的方法，包括以下步骤：
[0008]将待测样本与上述技术方案所述试剂混合进行染色，流式检测和分析，使用SS和FS确定细胞群，使用红细胞抗体通道设门确定红细胞群，使用SYTOX荧光信号设门标记不同成熟度的红细胞，SYTOX阴性代表成熟红细胞，SYTOX阳性代表红系前体细胞。
[0009]优选的是，所述待测样本的来源包括外周血；所述待测样本的细胞浓度为1
×
107～5
×
107个/mL。
[0010]优选的是，当待测样本的来源为小鼠外周血时，所述试剂中的红细胞抗体为
Ter119；当待测样本的来源为人外周血时，所述试剂中的红细胞抗体为CD235a。
[0011]优选的是，所述染色的时间为15～30min。
[0012]本专利技术还提供了SYTOX或上述技术方案所述试剂在制备肿瘤或血液系统疾病诊断试剂盒或骨髓造血功能评估试剂盒中的应用。
[0013]优选的是，所述血液系统疾病包括贫血。
[0014]本专利技术提供了SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用。SYTOX作为不易透过活细胞胞膜的核酸染料可用于染色死细胞，有核死细胞染色呈强阳性，外周血红细胞主要包括成熟红细胞与红系前体细胞(主要为IV期网织红细胞)，均是无核细胞，当SYTOX以适当比例染色时可透过网织红细胞胞膜染色线粒体，从而区分成熟红细胞与不成熟的红系前体细胞。本专利技术首次发现SYTOX染色也可以用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞。SYTOX染色用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞，灵敏度高、准确性高且一致性高，高效、简易且易推广。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1为本专利技术提供的流式分析肿瘤相关性贫血小鼠外周血红细胞成熟度结果图；
[0017]图2为本专利技术提供的正常小鼠与贫血小鼠外周血红细胞成熟度比较结果图；
[0018]图3为本专利技术提供的正常人和肿瘤患者外周血红细胞成熟度比较结果图；
[0019]图4为本专利技术提供的肿瘤患者外周血SYTOX
pos
红细胞与贫血的关系结果图；
[0020]图5为本专利技术提供的正常小鼠和贫血小鼠Mito tracker、CD71、SYTOX染色检测外周红细胞成熟度结果图；
[0021]图6为本专利技术提供的正常小鼠和贫血小鼠CD71、SYTOX染色检测外周红细胞成熟度对比结果图；
[0022]图7为本专利技术提供的正常人和肿瘤患者CD71、SYTOX染色检测外周血红细胞成熟度对比结果图。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用。SYTOX作为不易透过活细胞胞膜的核酸染料可用于染色死细胞，有核死细胞染色呈强阳性。本专利技术首次发现SYTOX染色也可以用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞。网织红细胞因胞质残存线粒体不断清除，染色呈连续中等至低强度荧光，成熟红细胞呈阴性，SYTOX染色用于区分外周血不同成熟阶段的红细胞灵敏度高；红细胞SYTOX染色荧光强弱与Mito tracker和CD71染色相符，说明使用SYTOX染色检测红细胞成熟度准确性一致性较高。本专利技术通过检测线粒体DNA评估外周血红细胞成熟度更准确。本专利技术通过简单的SYTOX染色即可实现红细胞成熟度的区分，更利于推广，本专利技术为网织红细胞染色计数提供了新策略，有一定的临床应用价值。
[0024]本专利技术还提供了一种检测外周血红细胞成熟度的试剂，所述试剂包括SYTOX和红
buffered saline，磷酸盐缓冲液)中，重悬血细胞，调整细胞浓度为5
×
107/ml，吸取200μL于96孔板中，1800r离心2min，弃上清，PBS洗涤1次，1800r离心2min得细胞沉淀；
[0033]2、流式染色：按样本种属配制流式抗体用于染色步骤1得到的细胞，根据样本种属
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小鼠样本使用抗体Pacific Blue anti
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mouse Ter1191:100(厂家：北京达科为生物技术有限公司；货号：116232)，人样本使用抗体APC anti
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human CD235a1:100(厂家：北京达科为生物技术有限公司；货号：349113)，分别与FITC
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SYTOX1:1000(厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；货号：S7020)配置于DMEM完全培养基(DMEM
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厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：C11995500BT；血清
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厂家本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SYTOX在检测外周血红细胞成熟度中的应用。2.一种检测外周血红细胞成熟度的试剂，其特征在于，所述试剂包括SYTOX和红细胞抗体。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述红细胞抗体包括Ter119或CD235a。4.一种非诊断目的的检测外周血红细胞成熟度的方法，包括以下步骤：将待测样本与权利要求2或3所述试剂混合进行染色，流式检测和分析，使用SS和FS确定细胞群，使用红细胞抗体通道设门确定红细胞群，使用SYTOX荧光信号设门标记不同成熟度的红细胞，SYTOX阴性代表成熟红细胞，SYTOX阳性代表红系前体细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱波，袁婷，陈德高，吴玉翠，边阳萍，吕浩，龙海霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：