本发明专利技术提供了一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，具体包括以下步骤：(1)外植体的选取；(2)对外植体超声波处理；(3)愈伤组织诱导：将超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养；(4)体胚诱导：将诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，暗培养，得到胚状体；(5)植株诱导：将胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可高效扩繁橡胶树植株。本发明专利技术利用超声波处理工艺对外植体进行适当加工，既可以对橡胶树体细胞胚进行微创伤处理，又能有效避免超声波处理对活体细胞组织的损伤。实验证实能有效提高SRJC扩繁效率，采用最佳处理条件的方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。的方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。的方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。
【技术实现步骤摘要】
一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法
[0001]本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法。
技术介绍
[0002]巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是中国和世界其他地区天然橡胶(NR)工业的主要原材料来源。自根幼态无性系(Self Rooting Juvenile Clone,SRJC)与芽接苗相比，具有生长快、产量高、抗性强的优点(陈雄庭等，2002)。目前，已有几种离体组织培养方法可获得橡胶树自根幼态无性系。其中次生体胚循环增殖是目前为止效率最高的方法(Hua等，2010；华玉伟等，2007)，每工人每年可生产2万株以上SRJC。依托该技术，我国已建成全球首个橡胶树SRJC规模化生产基地。
[0003]然而基于目前扩繁效率，SRJC生产成本是芽接苗的3倍，远高于芽接苗，生产单位对降低生产成本需求迫切，因此，急需探索出一种提高扩繁效率、降低SRJC生产成本的方法。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，利用超声波处理工艺对外植体加工从而提高SRJC扩繁效率。其原理在于：超声波发生器发出的高频振荡信号，产生数以万计的直径为50
‑
500μm的微小气泡，这些气泡爆炸时产生冲击波，形成几百度的高温和超过1000个气压的瞬间高压，可以在植物表面形成大量微小伤口，从而利于愈伤组织诱导分化。本专利技术通过选择适宜的外植体、超声波处理参数及方案设计，有效控制了超声波处理时组织损伤发生率、避免影响细胞的正常机制，进而得到高次生体胚扩繁效率，低SRJC生产成本的技术方案。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，具体包括以下步骤：
[0006](1)外植体的选取；
[0007](2)对外植体超声波处理；
[0008](3)愈伤组织诱导：将步骤(2)超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；
[0009](4)体胚诱导：将步骤(3)诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；
[0010](5)植株诱导：将步骤(4)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株。
[0011]在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述外植体为增殖世代小于10代的成熟子叶形胚状体。
[0012]在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理方法为：将步骤(1)得到的外植体置于保护装置内，再将保护装置放置于超声波清洗机中，进行超声波处理。
[0013]在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理条件为以10
‑
80kHZ处理5
‑
180s。
[0014]在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：以MS培养基为基础培养基，附加2,4
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D 1
‑
2mg/L，萘乙酸0.5
‑
1.5mg/L，激动素1
‑
2mg/L，天冬酰胺0.3g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖50
‑
70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8
‑
6.2。
[0015]在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养条件为：
[0016]在24
‑
28℃条件下，暗培养22
‑
30d。
[0017]在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述胚状体诱导培养基的成分为：
[0018]以MS培养基为基础培养基，附加6
‑
苄基氨基嘌呤0.5
‑
2mg/L，细胞激动素1
‑
3mg/L，2,4
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D 0.02
‑
0.06mg/L，赤霉素0.3
‑
0.8mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖50
‑
70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8
‑
6.2。
[0019]在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述体胚诱导培养条件为：
[0020]在24
‑
28℃条件下，暗培养50
‑
60d。
[0021]在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养基的成分为：
[0022]以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.2
‑
0.5mg/L，赤霉素2
‑
3mg/L，吲哚乙酸0.1
‑
0.3mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30
‑
50g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8
‑
6.2。
[0023]在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养条件为：
[0024]在24
‑
28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500
‑
3800Lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养40
‑
50d。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下优点：
[0026]1、本专利技术中，所用的超声波清洗设备价格低廉，超声波操作简单易行，耗时短、效率高，可大规模工业化加工处理。
[0027]2、本专利技术中通过选择适宜的外植体及将外植体置于保护装置中，既可以对橡胶树体细胞胚进行微创伤处理，又能有效避免超声波处理对活体细胞组织的损伤。室温及短时间的超声波处理参数也能进一步保护活体细胞组织，避免造成不可逆的致命作用。
[0028]3、本专利技术所提供的技术方案还具有如下经济和科研价值：
[0029]①
提高次生体胚发生率。
[0030]②
提高正常子叶胚诱导率。
[0031]③
提高SRJC成苗率。
[0032]④
提高SRJC扩繁效率，采用最佳处理条件的技术方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。
[0033]⑤
降低SRJC生产成本，推动SRJC在生产上推广应用。
[0034]⑥
该技术也可用于转化实验提高遗传转化效率。
[0035]⑦
优化后的参数保证了对植物细胞的无害作用及其机理。
[0036]⑧
本专利技术提供的超声波处理步骤可应用于其他物种体外扩繁(愈伤组织发生/器官形成)。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的选取；(2)对外植体超声波处理；(3)愈伤组织诱导：将步骤(2)超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；(4)体胚诱导：将步骤(3)诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；(5)植株诱导：将步骤(4)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株。2.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体为增殖世代小于10代的成熟子叶形胚状体。3.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声波处理方法为：将步骤(1)得到的外植体置于保护装置内，再将保护装置放置于超声波清洗机中，进行超声波处理。4.如权利要求3所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，所述超声波处理条件为以10
‑
80kHZ处理5
‑
180s。5.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：以MS培养基为基础培养基，附加2,4
‑
D 1
‑
2mg/L，萘乙酸0.5
‑
1.5mg/L，激动素1
‑
2mg/L，天冬酰胺0.3g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖50
‑
70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8
‑
6.2。6.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养条件为：在24
‑
28℃条件下，暗培养22
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30d。7.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄天带，吉努乌达亚巴努，王泳茹，吴日智，辛士超，黄华孙，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：
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