一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及免疫治疗技术领域，公开了一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法及其应用。该方法包括以下步骤：（1）取受精后45~50 h的斑马鱼幼鱼；（2）将人源免疫细胞注射到斑马鱼幼鱼的静脉窦中，获得人源免疫细胞移植斑马鱼模型。这种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法具有免疫细胞使用量和给药量少、检测通量高、实验周期短、无需进行免疫抑制催、便于观察和拍照的优点，能大大降低时间和经济成本，并能在人源免疫细胞和免疫检测点抑制剂的抗肿瘤效果评价中发挥较好的作用。肿瘤效果评价中发挥较好的作用。肿瘤效果评价中发挥较好的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫治疗
，尤其涉及一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法及其应用。

技术介绍

[0002]自2010年以来，癌症的发病率和死亡率持续上升，已成为世界上主要的死亡原因和主要的公共卫生问题之一。传统的癌症治疗方法，如手术、放疗和化疗，难以完全根除癌细胞。新兴的免疫疗法正在彻底改变多发性肿瘤的临床管理。免疫治疗的主要机制是改变肿瘤微环境或免疫细胞，使免疫系统达到杀死肿瘤的目的。靶向辅助免疫细胞的免疫治疗和基因编辑的免疫细胞过寄疗法被认为是治疗多种癌症的有前途的策略。
[0003]小鼠模型是研究与评估肿瘤免疫治疗效果的常用模型。其中，在小鼠体内重建人免疫系统是建立动物模型的关键。然而，目前广泛应用的小鼠模型并没有统一的重建人类免疫系统的方法与标准。另外，使用小鼠作为宿主进行免疫重建存在较多劣势，例如，重建过程中免疫细胞需求量巨大、免疫重建周期长、检测通量低，因此大大增加了研究者的时间和经济成本，对肿瘤免疫疗法的临床前研究与疗效评估造成一定的阻碍。
[0004]因此，提供一种免疫细胞使用量少、检测通量高、实验周期短的人源免疫细胞移植动物模型，对于免疫细胞和免疫检查点抑制剂抗肿瘤效果的研究具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了解决现有的小鼠模型免疫细胞需求量巨大、免疫重建周期长、检测通量低的技术问题，本专利技术提供了一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法及其应用。这种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法具有免疫细胞使用量和给药量少、检测通量高、实验周期短、无需进行免疫抑制催、便于观察和拍照的优点，并能用于人源免疫细胞和免疫检测点抑制剂的抗肿瘤效果评价。
[0006]本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法，包括以下步骤：（1）取受精后45~50 h的斑马鱼幼鱼；（2）将人源免疫细胞注射到斑马鱼幼鱼的静脉窦中，获得人源免疫细胞移植斑马鱼模型。
[0007]斑马鱼用于与人类的基因的同源性高达85%，且许多有关肿瘤的信号通路都与人类相类似，并且与人类一样，其自身也能够自发得癌。并且，相较于小鼠模型而言，采用斑马鱼进行肿瘤研究，还具有以下优点：体积小，所需的饲养空间小，饲养方便；繁育后代方便且数量多，可为实验提供充足的样本数量且价格便宜；所需移植的肿瘤细胞数量少；给药量少，给药方式方便；不需要进行免疫抑制处理，在其胚胎发育的前30天，其适应性的免疫功能并未完全形成；在幼年时期通体透明，能够方便地进行显微镜观察和拍照等。
[0008]本专利技术团队在对斑马鱼不同时期的发育特征进行研究，并结合大量试验后发现，在受精后2天（即2 dpf）左右注射人源免疫细胞（如人源T细胞、人源自然杀伤细胞、人源巨噬细胞）后，人源免疫细胞在斑马鱼血管内迁移，其数量随着时间的推移先增加后减少，在受精后3~5天（即3~5 dpf）左右斑马鱼体内的人源免疫细胞数量维持在较高水平。并且，若在受精后3天左右向斑马鱼体内注射肿瘤细胞，则继续培养的2天时间足够使人源免疫细胞表现抗肿瘤作用；若在受精后3天左右向斑马鱼体内注射肿瘤细胞和免疫监测点抑制剂，则继续培养的2天时间也足够免疫监测点抑制剂表现出抗肿瘤作用。因此，本专利技术通过在2 dpf左右注射人源免疫细胞构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型，能够用于人源免疫细胞和免疫检测点抑制剂的抗肿瘤效果评价。
[0009]作为优选，步骤（2）中，所述人源免疫细胞为人源T细胞、人源自然杀伤细胞和人源巨噬细胞中的一种或多种。
[0010]作为优选，步骤（2）中，所述人源免疫细胞的注射量为每条斑马鱼80~250个。
[0011]第二方面，本专利技术提供了所述方法在评价免疫细胞抗肿瘤效果中的应用。
[0012]作为优选，所述应用包括以下步骤：S1：设置对照组和实验组；对照组的斑马鱼不注射人源免疫细胞；实验组的斑马鱼按照所述方法构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型；S2：将对照组和实验组的斑马鱼继续培养至受精后70~75 h，将人肿瘤细胞移植到斑马鱼体内；S3：将斑马鱼继续培养至受精后115~150 h，对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量；对比实验组和对照组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量，据此评价所述人源免疫细胞对肿瘤细胞是否具有杀伤作用。
[0013]当实验组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量显著少于对照组时，表明所述人源免疫细胞对肿瘤细胞有杀伤作用，当实验组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量与对照组无显著差异时，表明所述人源免疫细胞对肿瘤细胞不具有杀伤作用。
[0014]进一步地，所述人源免疫细胞为人源T细胞和/或人源巨噬细胞；步骤S3中，将斑马鱼继续培养至受精后115~125 h，对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量。
[0015]本专利技术发现，在2 dpf左右注射人源T细胞或人源巨噬细胞，则在3~5 dpf期间，斑马鱼体内的人源T细胞或人源巨噬细胞维持在较高水平，且较为稳定，因此，可在受精后115~125 h对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量。而对于人源自然杀伤细胞而言，在3~6 dpf期间，斑马鱼体内的人源自然杀伤细胞维持在较高水平，且较为稳定，因此，可在受精后115~150 h对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量。
[0016]进一步地，步骤S2中，所述人肿瘤细胞的移植量为每条斑马鱼250~350个。
[0017]第三方面，本专利技术提供了所述方法在评价免疫检查点抑制剂抗肿瘤效果中的应用。
[0018]作为优选，所述应用包括以下步骤：S1：设置人源免疫细胞移植组和人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组，两组的斑马鱼均按照所述方法构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型；S2：将人源免疫细胞移植组和人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组的斑马鱼继续培养至受精后70~75 h，将人肿瘤细胞移植到斑马鱼体内，并将免疫检查点抑制剂注射到人
源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组的斑马鱼体内；S3：将斑马鱼继续培养至受精后115~150 h，对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量；对比人源免疫细胞移植组和人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量，据此评价所述免疫检查点抑制剂能否促进所述人源免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0019]当人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量显著少于人源免疫细胞移植组时，表明所述免疫检查点抑制剂能够促进所述人源免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，当人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量与人源免疫细胞移植组无显著差异时，表明所述免疫检查点抑制剂不能促进所述人源免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0020]进一步地，步骤S1中，设置对照组，该组的斑马鱼不注射人源免疫细胞；步骤S2和S3中，对照组的处理方式与人源免疫细胞移植组相同。
[0021]进一步地，步骤S1中，设置免疫检查点抑制剂组，该组的斑马鱼不注射人源免疫细胞；步骤S2和S3中，免疫检查点抑制剂组的处理方式与人源免疫细胞+免疫检查点抑制剂组相同。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取受精后45~50 h的斑马鱼幼鱼；（2）将人源免疫细胞注射到斑马鱼幼鱼的静脉窦中，获得人源免疫细胞移植斑马鱼模型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述人源免疫细胞为人源T细胞、人源自然杀伤细胞和人源巨噬细胞中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述人源免疫细胞的注射量为每条斑马鱼80~250个。4.如权利要求1~3之一所述方法在评价免疫细胞抗肿瘤效果中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1：设置对照组和实验组；对照组的斑马鱼不注射人源免疫细胞；实验组的斑马鱼按照所述方法构建人源免疫细胞移植斑马鱼模型；S2：将对照组和实验组的斑马鱼继续培养至受精后70~75 h，将人肿瘤细胞移植到斑马鱼体内；S3：将斑马鱼继续培养至受精后115~150 h，对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量；对比实验组和对照组斑马鱼体内的肿瘤细胞数量，据此评价所述人源免疫细胞对肿瘤细胞是否具有杀伤作用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述人源免疫细胞为人源T细胞和/或人源巨噬细胞；步骤S3中，将斑马鱼继续培养至受精后115~125 h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪文钰，朱晓宇，金晓立，张涛，李春启，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：