一种靶向肝脏并改善脂质沉积的miRNA仿生纳米硒颗粒，其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向肝脏并改善脂质沉积的miRNA仿生纳米硒颗粒、制备和应用；将miR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肝脏并改善脂质沉积的miRNA仿生纳米硒颗粒，其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及药物
，提供一种基于血小板膜包被的miRNA仿生纳米硒颗粒靶向肝脏并改善脂质沉积的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver, NAFLD）是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的慢性炎症性代谢疾病。目前，全球NAFLD的患病率高达30%，患者常伴有肥胖、II型糖尿病和胰岛素抵抗的症状，进一步可发展为肝纤维化，甚至是肝癌。此外，流行病学研究发现，NAFLD患者的血硒水平显著降低，表明微量元素
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硒与糖脂代谢之间存在着某种联系。几年来，虽然临床上用于治疗NAFLD的药品种类繁多，但大多存在副作用大、疗效不确切等问题，NAFLD伴随并发症的风险以及缺乏认可的疗法是治疗该疾病的重大障碍，因此，急需设计或改良现有药物以治疗NAFLD或逆转相关肝脏并发症。
[0003]目前，临床上用于治疗疾病的药物大多为化学小分子药物与抗体类药物，其靶点多为蛋白质，包括激酶、抗原和受体等。而在人类基因组中，与人类疾病相关的致病蛋白约80%为不成药蛋白，难以被靶向。因此，为满足临床需求，小核酸药物应运而生，使药物靶点扩大至蛋白质上游，能特异性上调或下调靶基因的表达，使得治疗更加精准和个性化，在人类重大疾病的治疗中展现巨大潜力。其中，微小RNA(MicroRNA,miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过与靶基因3
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端非编码区(Untranslated region，UTR)互补配对，使靶基因降解或抑制其翻译，从而抑制下游蛋白表达，达到疾病治疗的作用。然而，体外合成的未进行修饰的miRNA进入体内后易被血清中的核酸酶降解，难以高效稳定的进行递送；化学修饰的miRNA合成成本较高，非靶向效应带来了严重的毒副作用可能影响临床效果。因此，开发低毒高效的纳米载体靶向递送miRNA至疾病部位、延长miRNA在体内的循环时间具有重要的临床意义。
[0004]硒（Selenium, Se）是一种人体必须的微量元素，由于其营养
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毒性剂量范围窄，一直以来备受国内外研究人员的关注。研究表明，纳米尺寸零价的硒颗粒（Selenium nanoparticles, SeNPs）具有独特的抗氧化性质和良好的生物相容性，是一种非常理想的纳米药物及药物载体。此外，最近的研究证明，血小板膜为纳米颗粒涂层提供了潜在的优势。血小板是从骨髓中成熟巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，血小板在人体中大量产生，循环中平均存活7
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10天。血小板可通过膜表面CD47介导的巨噬细胞逃逸和CD55/59介导的补体激活避免免疫系统被激活，并且以依赖于GPIbα糖蛋白的方式被肝细胞内吞。因此，利用血小板天然归巢肝脏及免疫逃逸的特点，设计和构建仿血小板的纳米硒载药系统，包被miRNA，有望增加miRNA对肝脏的靶向递送。最终实现硒与miRNA的协同作用，提高靶部位药物浓度，增加疗效。
[0005]调研发现，目前暂无利用血小板膜包被的纳米硒颗粒负载miR
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3p靶向肝脏
改善脂质沉积的相关研究及相关的专利申请。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术存在的上述的缺陷，提供如下的技术方案：本专利技术的第一个方面提供一种仿生纳米硒颗粒，所述的仿生纳米硒颗粒由血小板膜包被的miRNA仿生纳米硒颗粒组成，其中所述的miRNA为miR
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3p inhibitor。在一个具体的实施例中，所述的miR
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3p inhibitor的序列为ACAAAGUUCUGUAGUGCACUGA(SEQ ID NO:1)；优选的，所述的miR
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3p inhibitor序列被甲基化修饰，进一步的，所述的修饰为对inhibitor中的每一个碱基进行甲基化修饰，其序列为mAmCmAmAmAmGmUmUmCmUmGmUmAmGmUmGmCmAmCmUmGmA(SEQ ID NO:2)；在一个具体的实施例中，所述的纳米硒为壳聚糖在维生素C存在的条件下还原Na2SeO3制备而得；所述的仿生纳米硒颗粒直径在70
±
5nm，所述的仿生纳米硒颗粒吸附miRNA的包封率为73
±
5%。
[0007]本专利技术的第二个方面是提供一种仿生纳米硒颗粒的制备方法，所述的方法包括：1）采用维生素C（VC）原位还原Na2SeO3方法制备壳聚糖
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纳米硒颗粒；2）miR
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3p inhibitor母液与壳聚糖
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纳米硒溶液充分混合，涡旋振荡；3）全血中收集血小板沉淀，用含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液重悬，置于
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80℃冰箱后反复冻融得到血小板膜碎片，对其进行超声10
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15分钟处理后得血小板膜囊泡；4）将步骤3）获得的血小板膜囊泡通过滤膜的脂质体挤出器，经物理挤压均一粒径后获得血小板膜；5）将步骤4）获得的血小板膜与步骤2）获得的纳米硒溶液混合，孵育，超声，通过滤膜的脂质体挤出器，共挤出后离心除去多余囊泡，获得包封的仿生纳米硒颗粒；6）进行透射电子显微镜观察，分散系数测定以及zeta单位测定；粒径测定。
[0008]在一个具体的实施方式中，步骤1）的操作为：壳聚糖溶于1%的冰乙酸中，重量体积比为1%
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2%；500
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800r/min避光磁力搅拌10
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14h；缓慢滴入15
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30mmol/L的亚硒酸钠溶液，00
‑
800r/min磁力搅拌20
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40min；缓慢滴入80mmol/L的Vc溶液，600r/min磁力搅拌30min后转入试剂瓶，置于4℃冰箱保存，其中亚硒酸钠溶液和Vc溶液体积以及冰乙酸的体积相同。
[0009]在另外一个具体的实施例中，其中，步骤2）的操作为取10μM的FAM标miR
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3p inhibitor母液与壳聚糖
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纳米硒溶液以1：60
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80的体积比充分混合，涡旋振荡，50
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60℃孵育1
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2h使其充分结合形成核酸复合体；离心取上清液置于石英比色皿，荧光分光光度计测定荧光强度（激发波长485nm，发射波长524nm）并计算包封率；包封率(%）=（A
离心前
‑
A
离心后
）/A
离心前
ꢀ×
100%。
[0010]在另外一个具体的实施例中，其中步骤4）的操作是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿生纳米硒颗粒，所述的仿生纳米硒颗粒由血小板膜包被吸附miRNA纳米硒颗粒组成，其中所述的miRNA为miR
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3p inhibitor。2.根据权利要求1所述的仿生纳米硒颗粒，所述的仿生纳米硒颗粒直径在70
±
5nm，所述的仿生纳米硒颗粒吸附miRNA的包封率为73
±
5%；所述的miR
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3p inhibitor的序列为ACAAAGUUCUGUAGUGCACUGA（SEQ ID NO:1）。3.一种制备权利要求1或2所述的仿生纳米硒颗粒的制备方法，所述的方法包括：1）采用维生素C（VC）原位还原Na2SeO3方法制备壳聚糖
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纳米硒颗粒；2）miR
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3p inhibitor母液与壳聚糖
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纳米硒溶液充分混合，涡旋振荡；3）全血中收集血小板沉淀，用含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液重悬，置于
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80℃冰箱后反复冻融得到血小板膜碎片，对其进行超声10
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15分钟处理后得血小板膜囊泡；4）将步骤3）获得的血小板膜囊泡通过滤膜的脂质体挤出器，经物理挤压均一粒径后获得血小板膜；5）将步骤4）获得的血小板膜与步骤2）获得的纳米硒溶液混合，孵育，超声，通过滤膜的脂质体挤出器，共挤出后离心除去多余囊泡，获得包封的仿生纳米硒颗粒；6）进行透射电子显微镜观察，分散系数测定以及zeta单位测定；粒径测定。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中，步骤1）的操作为：壳聚糖溶于1%的冰乙酸中，重量体积比为1%
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2%；500
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800r/min避光磁力搅拌10
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14h；缓慢滴入15
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30mmol/L的亚硒酸钠溶液，00
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800r/min磁力搅拌20
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40min；缓慢滴入80mmol/L的Vc溶液，600r/min磁力搅拌30min后转入试剂瓶，置于4℃冰箱保存，其中亚硒酸钠溶液和Vc溶液体积以及冰乙酸的体积相同。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤2）的操作为取10μM的FAM标miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄家强，李桐，罗云，王连顺，董玉兰，王鹏杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：