检测用复合物及其制备方法和应用技术

一种检测用复合物，其包括靶标识别部，所述靶标识别部是抗体；核酸片段，通过偶联剂与所述靶标识别部共价连接；和，核酸染料，荷载在所述核酸片段上。本发明专利技术还提供了该检测用复合物的制备方法，以及检测方法。以及检测方法。

【技术实现步骤摘要】
检测用复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种荷载核酸染料的抗体
‑
核酸偶联物，及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]很长时期以来，各种抗体和抗体偶联物在生物医学科学研究领域有着广泛的应用，各种带有标记的抗体，在免疫细胞组化、流式细胞术、酶联免疫实验(ELISA)和蛋白免疫印迹等领域，有着广泛的应用。在这些应用中，通常使用直接偶联标记物的抗体(包括一抗和二抗)。
[0003]近年来，人们发展了将核酸分子与抗体结合。核酸分子具有高载荷特征。多种荧光核酸染料分子或者其它化合物分子，可以与双链核酸分子结合。例如，溴化乙锭、碘化丙啶等核酸嵌入剂，可插入到核酸分子的碱基对之间；4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)、Hoechst等染料，可结合在双链核酸分子的小沟上。
[0004]可使用异源双功能交联剂，例如使用琥珀酰亚胺基4
‑
肼基鸟氨酸丙酮腙(SANH)和琥珀酰亚胺基4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐(SMCC)，在核酸分子和抗体之间形成桥接。目前通常使用偶联剂将小分子与核酸分子直接共价结合在一起来获得抗体
‑
核酸分子偶联物。但是，这种直接共价结合，需要对核酸分子进行特定的修饰。传统的化学试剂偶联抗体
‑
染料或者核酸分子
‑
染料技术过于繁杂耗力，且价格昂贵，实验室难以自行制备。
[0005]因此，亟需一种简单的方法获得灵敏且易于使用的标记物，该标记物中染料分子通过非共价方式与核酸分子结合，一方面可避免核酸分子在合成和修饰上的巨大成本，另一方面，方便在实验室自行制备。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本专利技术提供了一种检测用复合物，及其制备方法和应用。
[0007]根据本公开的一个方面，提供了一种检测用复合物，所述复合物包括：靶标识别部，所述靶标识别部是抗体；核酸片段，通过偶联剂与所述靶标识别部共价连接；和，核酸染料，荷载在所述核酸片段上。
[0008]根据本公开的一些实施方式，所述核酸片段是双链DNA片段或单链DNA片段。根据本公开的一些实施方式，所述核酸片段是双链DNA。根据一些具体的实施方式，所述核酸片段通过PCR扩增获得。
[0009]根据本公开的一些实施方式，所述核酸片段具有10至250个碱基或碱基对。根据一些具体的实施方式，所述核酸片段具有200至250个碱基或碱基对。
[0010]根据本公开的一些实施方式，所述靶标识别部特异性识别靶标。根据本公开的一些实施方式，所述靶标识别部是免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')2或单链抗体(scFv)。根据一些具体的实施方式，所述靶标识别部是抗体，例如是一抗或者二抗。根据一些具体的实施方
式，所述抗体溶解在含乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液中，例如含EDTA的磷酸盐缓冲液中。EDTA可以螯合二价离子，有双重作用，抑制二硫键的生成和抑制DNaseI，从而能够保护核酸分子。根据一些具体的实施方式，所述抗体经脱盐处理后，再溶解在含EDTA的磷酸盐缓冲液中。
[0011]根据本公开的一些实施方式，所述偶联剂选自琥珀酰亚胺4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐(SMCC)、4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo
‑
SMCC)、(1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)(EDC)或N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)。
[0012]根据本公开的一些实施方式，所述核酸片段具有线性、环状或其他立体结构。
[0013]根据本公开的一些实施方式，所述核酸染料是荧光染料，优选选自花色素菁类染料、GelGreen
TM
、GelRed
TM
、溴化乙锭、碘化丙啶、4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚、Hoechst染料、吖啶橙类染料、溴乙啡锭二聚体(EthD)、7
‑
氨基放线菌素D(7
‑
AAD)和其类似物。
[0014]根据本公开的另一方面，提供了一种用于制备本公开的复合物的方法，所述方法包括：使用偶联剂对靶标识别部进行活化，得到带偶联剂的靶标识别部；和，所述带偶联剂的靶标识别部分经脱盐处理后，与核酸片段发生偶联反应，得到靶标识别部
‑
核酸片段的复合物。
[0015]根据本公开的一些实施方式，在与所述带偶联剂的靶标识别部分发生偶联反应之前，所述核酸片段与核酸染料孵育以荷载上所述核酸染料。然后，荷载有所述核酸染料的核酸片段再与所述靶标识别部进行偶联反应，以得到靶标识别部
‑
核酸片段
‑
核酸染料复合物。
[0016]根据本公开的一些实施方式，在得到所述靶标识别部
‑
核酸片段的复合物之后，将所述靶标识别部
‑
核酸片段与核酸染料孵育，以在所述核酸片段上荷载上所述核酸染料，得到靶标识别部
‑
核酸片段
‑
核酸染料复合物。
[0017]根据本公开的一些实施方式，所述靶标识别部
‑
核酸片段的复合物进行脱盐处理后，再与核酸染料孵育，以荷载核酸染料。根据本公开的一些实施方式，所述核酸片段与核酸染料孵育，并进行脱盐处理之后，再与所述所述带偶联剂的靶标识别部分发生偶联反应。通过脱盐处理能够显著提高核酸染料在核酸片段上的荷载量，相应提高本公开的靶标识别部
‑
核酸片段
‑
核酸染料复合物的荧光强度。
[0018]根据本公开的一些实施方式，所述脱盐处理使用脱盐柱进行。脱盐柱中可填装有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合制作的琼葡糖凝胶。在具体的实施方式中，所述脱盐柱可以为SpinOUT
TM
去盐柱、Zeba
TM
脱盐离心柱等。
[0019]根据本公开的又一方面，提供了一种检测样本的方法，所述方法包括使用本公开的复合物与样本接触。
[0020]根据本公开的一些实施方式，所述样本包括含靶标的物质，例如包括细胞、组织、器管、体液、血液、生物体等。
[0021]常用的DNA染料包括花色素菁类染料、GelGreen
TM
、GelRed
TM
、溴化乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)、4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)、Hoechst染料、吖啶橙类染料、溴乙啡锭二聚体3(EthD
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测用复合物，其特征在于，所述复合物包括：靶标识别部，所述靶标识别部是抗体；核酸片段，通过偶联剂与所述靶标识别部共价连接；和核酸染料，荷载在所述核酸片段上。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述核酸片段是双链DNA片段或单链DNA片段，优选是双链DNA片段。3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述核酸片段来自聚合酶链式反应(PCR)或者人工合成的寡聚核苷酸退火，具有20至250个碱基或碱基对。4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其特征在于，所述抗体选自免疫球蛋白、Fab、Fab'、(Fab')2或单链抗体scFv。5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物，其特征在于，所述偶联剂选自琥珀酰亚胺4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐、4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、(1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)或N
‑
羟基丁二酰亚胺。6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物，其特征在于，所述核酸染料是能通过嵌合方式与所述核酸片段非共价结合的荧光染料，优选选自花色素菁类染料、GelGreen
TM
、GelRed
TM
、溴化乙锭、碘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王青松，吴江，彭程，
申请(专利权)人：启东启晨生物科技有限公司北京大学生命科学华东产业研究院，
类型：发明
国别省市：