一种抗虫蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新抗虫蛋白及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术提供了一种新杀虫蛋白及其编码基因，以及其在培育抗虫作物中的应用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种抗虫蛋白及其制备方法和应用，具体为改造的Cry1Ia蛋白。

技术介绍

[0002]目前，商业化的转基因抗虫玉米中，含有Cry1Ab蛋白(例如MON810、DBN9936)的玉米具有很好的玉米螟控制效果。然而，随着转基因抗虫玉米产业化种植规模逐步扩大，国外已有报道玉米螟对Cry1Ab玉米产生了抗性。为了提前做好玉米螟的抗性管理，开发不具Cry1A类交互抗性的抗虫玉米是有效的管理手段之一。已有研究表明，Cry1I与Cry1Ab没有交互抗性，替换或者与该蛋白进行叠加，可以延缓玉米螟抗药性的产生(Xu L,Wang Z,Zhang J,et al.Cross
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resistance of Cry1Ab
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selected Asian corn borer to other Cry toxins[J].Journal of Applied Entomology,2010,134(5):429
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438.)。
[0003]在已经鉴定到的Cry类Bt抗虫基因(苏云金芽胞杆菌bacillus thuringiensis基因，简称Bt基因)中，Cry1I类蛋白具有独特性，其在苏云金芽孢杆菌菌株中通常是沉默基因，但在大肠杆菌培养中可以以大约81kDa的原毒素形式表达，这是Cry1类蛋白中独一无二的分子质量。此外，Cry1I类蛋白的靶标昆虫种类包括鳞翅目和鞘翅目，且与Cry1A类蛋白不会产生交互抗性。因此，Cry1I类基因的研究具有更为重要的理论意义和实用价值，并将为解决Bt毒素杀虫谱较窄、害虫抗药性产生等问题提供新的基因选择。但目前鲜有文献报道Cry1I类基因在抗虫方面的研究及性能验证。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术中存在的至少一个问题，在前期实验中，专利技术人发现Cry1Ia1对玉米螟具有较好的活性，对杀虫蛋白毒性区的改造能够进一步增强蛋白的杀虫活性。因此，本专利技术通过改造Cry1Ia1蛋白获得更佳的玉米螟杀虫活性并应用于抗虫玉米的开发，其具有很好的商业化应用前景。
[0005]在前期研究中，专利技术人通过连续易错PCR方法对编码Cry1Ie1蛋白的核酸分子进行突变，并将突变子表达蛋白，然后通过玉米螟生测试验筛选出了有更高杀虫活性的突变蛋白，分析编码蛋白的核苷酸序列，找到了突变位点。因为Cry1Ia与Cry1Ie同属于Cry1I类蛋白，在上述前期研究的基础上，本专利技术在Cry1Ia中找到同源的活性位点并进行突变，然后通过玉米螟生测筛选出优于Cry1Ia1的三种重组蛋白。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一个方面是提供一种抗虫蛋白，其为改造的Cry1Ia蛋白；其中，所述改造的Cry1Ia蛋白含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列且在以下位点中的至少一个进行突变：第82、99、113、147、182、214、233位氨基酸。进一步地，在第113、182、233位氨基酸中的至少一个进行突变。
[0008]进一步地，所述改造的Cry1Ia蛋白具有的突变位点包括：Y233N、E182K、N113S+
E182V、V82N+N113S+E182V、N113S+E182V+Y233N、E182V、V82N+E182V、E182K+Y233N、E182V+Y233N、N99S+N113S+E182V、Y233N或G147S+S214N+Y233N；更进一步地，所述改造的Cry1Ia蛋白具有的突变位点为Y233N、E182K或N113S+E182V。
[0009]进一步地，所述改造的Cry1Ia蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6～SEQ ID No.8所示；具体地，Y233N突变对应的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，E182K突变对应的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示，N113S+E182V突变对应的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。
[0010]本专利技术的第二个方面是提供一种用于编码任一上述的抗虫蛋白的核酸分子，其中，编码所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步地，编码所述SEQ ID No.6～SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的核酸序列分别如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5所示；具体地，编码所述SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID No.3所示，编码所述SEQ ID No.7所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID No.4所示，编码所述SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0012]上述涉及的氨基酸及核酸序列如下表1所示：
[0013]表1
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抗虫蛋白相关的序列信息
[0014][0015][0016][0017][0018][0019]本专利技术的第三个方面是提供一种与任一上述的抗虫蛋白或与任一上述的核酸分子相关的生物材料，其包括含有如任一上述的核酸分子的重组载体、重组微生物、重组细胞系。
[0020]进一步地，所述重组载体为pET28a表达载体，其也可替换为本领域常规使用的合适的其他表达载体。
[0021]进一步地，所述重组细胞系为大肠杆菌BL21细胞系，也可采用合适的其他菌株类型的大肠杆菌他细胞系。
[0022]本专利技术的第四个方面是提供一种任一上述的抗虫蛋白的制备方法，其包括步骤：在编码Cry1Ia蛋白的如SEQ ID NO.2所述的核酸序列上，根据对应的突变位点通过同源重组的方法(如：连续易错PCR策略)对其核酸序列进行改造，再将突变后的核酸分子构建到pET28a表达载体中，并转入大肠杆菌BL21细胞系，进行改造的Cry1Ia蛋白表达。
[0023]进一步地，在设计编码Cry1Ia蛋白的核酸序列时，其密码子设置为大肠杆菌(K12
菌株)偏爱性，并避免XhoI和HindIII酶切位点；将突变后的核酸分子克隆到pET28a表达载体中限制性内切酶XhoI和HindIII的位点之间，获得蛋白表达载体。
[0024]进一步地，大肠杆菌BL21细胞系中蛋白表达的具体步骤包括：单个菌落接种到LB液体培养基，培养至培养基浑浊，取菌液加入IPTG(Isopropyl
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β
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D
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thiogalactoside)，继续培养，在获得的菌液中加入上样缓冲液制样电泳，根据阴性对照和加入IPTG诱导的结果对比，判断是否有表达；有表达的菌液接种到LB液体培养基中培养，获得种子液，种子液再接种到LB液体培养基培养，然后加IPTG继续培养；获得的培养液经过离心沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀；沉淀中加缓冲液，超声破碎，离心后检测上清液是否含有重组蛋白。
[0025]本专利技术的第五个方面是提供一种任一上述的抗虫蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗虫蛋白，其特征在于，所述抗虫蛋白为改造的Cry1Ia蛋白；其中，所述改造的Cry1Ia蛋白含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列且在以下位点中的至少一个进行突变：第82、99、113、147、182、214、233位氨基酸。2.根据权利要求1所述的抗虫蛋白，其特征在于，所述改造的Cry1Ia蛋白具有的突变位点为：Y233N、E182K或N113S+E182V。3.根据权利要求2所述的抗虫蛋白，其特征在于，所述改造的Cry1Ia蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6～SEQ ID No.8所示。4.一种用于编码如权利要求1～3中任一所述的抗虫蛋白的核酸分子，其特征在于，编码所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于，编码所述SEQ ID No.6～SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的核酸序列分别如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5所示。6.一种与权利要求1～3中任一所述的抗虫蛋白或与权利要求4～5中任一所述的核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉静，陈洪国，邹晶晶，曾祥玲，杨洁，蔡璇，龚莉君，李晨，
申请(专利权)人：武汉莱肯博奥科技有限公司，
类型：发明
国别省市：