一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用制造技术

本发明专利技术公布一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用。该酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其表达的酯酶EstF最适pH为9.0，最适温度55℃，热稳定性良好，100℃下的半衰期为4h。利用定点突变技术，设计突变引物，以重组质粒pET

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体是一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用。

技术介绍

[0002]酯酶(Esterases,EC3.1.1.X)是指具有催化水解酯键能力的一类水解酶的统称，广泛分布于动物、植物和微生物中，其主要分成两类：羧酸酯酶和脂肪酶，其中羧酸酯酶倾向于水解短链酯类(<10)，脂肪酶倾向于水解长链酯类(≥10)。作为一种在工业生产中被广泛使用的生物酶类，由于酯酶催化底物合成和水解时不需要辅助因子，在有机溶剂中具有很高的稳定性，立体特异性和区域专一性等特点，酯酶被广泛应用于医药工业领域，其不仅可以促进血脂降解、预防肿瘤生成、调节肠胃消化、促进炎症消散，还可以通过专一性的特点识别催化合成特定构象的化合物，用于药物合成；化工生产领域，参与油脂加工、拆分手性化合物和降解高分子化合物等过程，生物修复领域，通过水解农药残留、抗生素或塑化剂实现对环境污染物的清除作用。
[0003]热稳定性是判断酯酶是否具有工业应用价值的一个重要指标，所以与常温酶相比，热稳定酶即便在极端环境下也具有更长的工作寿命和更高的催化效率，因此具有更广阔的应用前景，在中温宿主中异源表达的热稳定型酶多数保留了原始酶的生化性质，包括正确的折叠、热稳定性、酶的催化性能等。因此重组热稳定性酶的研究为理解酶的进化、蛋白质耐热的分子机制和温度对酶催化功能的影响等提供了理想的对象。已有研究表明静电相互作用、疏水性、螺旋含量、特定氨基酸、氢键、二硫键、离子键等因素可能对酯酶的热稳定性有一定影响。
[0004]理性设计是基于对酶的结构与功能关系规律认识基础上，精确设计出突变位点，利用定点突变等方法实现蛋白质分子的定向改造。理性设计需要基于蛋白质的二级、三级结构、生物学功能以及催化机制等，对氨基酸序列进行精确的设计，并对其中特定的氨基酸进行替换，从而鉴定出与酶特性相关的关键氨基酸位点，这是一种高效省力的方法。定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变在获悉目标酶分子特征，空间结构以及构效关系的前提下，基于序列的合理化设计方案，有目的地对酶分子实施人工改造，因其高效性更多地应用于分子工程改造中。
[0005]在工业生产，临床诊疗等实际应用中，极其需要目标酶分子具有良好的热稳定性，从而易于保存，通过定点突变改造这些天然酶就显得尤为必要。但正确预测出有效位点并选择合适氨基酸进行替换以达到提高酶稳定性的目的在实际操作中难度较大。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提出了一种热稳定型酯酶及其突变体和应用。本专利技术的酯酶由人工设计合成的estF基因所编码，通过异源表达构建带有该基因的表达载体
和基因工程菌；通过定点突变技术对该酯酶进行理性改造，分别将其氨基酸序列中的144位脯氨酸变为甘氨酸和203位精氨酸变为赖氨酸，得到两个酯酶突变体P144G和R203K。相对于酯酶EstF，酯酶突变体具有更加优异的热稳定性。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：包括酯酶编码基因、编码蛋白EstF、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K；
[0008]所述酯酶编码基因，具有碱基序列SEQ ID NO：1，共1338bp，A含量为15.2％，T含量为19.4％，G含量为38.0％，C含量为27.4％；
[0009]优选的，所述编码蛋白EstF，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2，共445个氨基酸，分子量为45.7kDa，等电点位为4.84，其中包含35个能增加蛋白质刚性的脯氨酸；
[0010]优选的，所述酯酶突变体P144G，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，144位的脯氨酸突变为甘氨酸。所述酯酶突变体根据酯酶EstF与同源酯酶进行基于二级结构序列比对确定突变氨基酸位点；依据定点突变技术及大肠杆菌密码子偏好性原则，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第144位氨基酸的密码子CCG突变为GGA；
[0011]优选的，所述酯酶突变体R203K，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，203位的精氨酸突变为赖氨酸，所述的酯酶突变体R203K是基于酯酶EstF与同源酯酶二级结构序列比对和大肠杆菌中密码子使用频率的原则，通过定点突变技术将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第203位氨基酸密码子CGU突变为AAA。
[0012]优选的，所述编码蛋白EstF具有良好的酶学性质，酶活为112.83U/mg，具优良的热稳定性，100℃下的半衰期为4h。
[0013]优选的，所述酯酶突变体P144G，具有比所述编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育3h，酯酶活性保留87％，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活仍有75％。
[0014]优选的，所述酯酶突变体R203K，具有比所述的编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活性仍保持在80％以上。
[0015]优选的，所述三种重组质粒，其包含以上所述的酯酶基因estF的pET28b
‑
estF、estF
’
(编码酯酶突变体P144G基因)的pET28b
‑
estF
’
或estF”(编码酯酶突变体R203K基因)的pET28b
‑
estF”。
[0016]优选的，所述的3种酯酶基因重组工程菌，其包含上述的重组质粒，该重组工程菌为Rosetta(DE3)pLysS/pET28b
‑
estF、Rosetta(DE3)pLysS/pET28b
‑
estF
’
或Rosetta(DE3)pLysS/pET28b
‑
estF”。
[0017]优选的，所述酯酶编码基因、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K用于医药工业、化工生产、生物修复等领域的应用，所述的应用包括促进血脂降解、预防肿瘤生成、调节肠胃消化、促进炎症消散、药剂合成医药领域，参与油脂加工、拆分手性化合物和降解高分子化合物等化工生产过程，通过水解农药残留、抗生素或塑化剂实现对环境污染物清除作用的生物修复领域。
[0018]本专利技术的有益之处在于：
[0019]1.本专利技术合成了酯酶estF基因，并将其与pET28b质粒连接构建具卡那霉素(Kan)抗性的重组表达载体pET28b
‑
estF，将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，成功构建用于estF表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b
‑
estF，随后通过Co
2+
离子亲和层析，获
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：包括酯酶编码基因、编码蛋白EstF、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K；所述酯酶编码基因，具有碱基序列SEQ ID NO：1，共1338bp，A含量为15.2％，T含量为19.4％，G含量为38.0％，C含量为27.4％。2.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述编码蛋白EstF，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2，共445个氨基酸，分子量为45.7kDa，等电点位为4.84，其中包含35个能增加蛋白质刚性的脯氨酸。3.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体P144G，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，144位的脯氨酸突变为甘氨酸。所述酯酶突变体根据酯酶EstF与同源酯酶进行基于二级结构序列比对确定突变氨基酸位点；依据定点突变技术及大肠杆菌密码子偏好性原则，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第144位氨基酸的密码子CCG突变为GGA。4.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体R203K，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，203位的精氨酸突变为赖氨酸，所述的酯酶突变体R203K是基于酯酶EstF与同源酯酶二级结构序列比对和大肠杆菌中密码子使用频率的原则，通过定点突变技术将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第203位氨基酸密码子CGU突变为AAA。5.根据权利要求2所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述编码蛋白EstF具有良好的酶学性质，酶活为112.83U/mg，具优良的热稳定性，100℃下的半衰期为4h。6.根据权利要求3所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体P144G，具有比...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝娟，房金鑫，汤慧良，吴爽，马劲雪，桂心平，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：