用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用，其中用于水稻粒增重的重组载体，基础质粒包括定点编辑后的GS1；3基因组，所述定点编辑后的GS1；3基因组包括gRNA序列碱基，所述gRNA序列碱基为GS1；3基因组的第954位到第974位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT。本发明专利技术提供的用于水稻粒增重的重组载体以GS1；3基因组为基础，利用基因工程技术手段对该基因组进行定向编辑，获得的转基因材料在不影响水稻正常营养生长的前提下，可显著增加粒形，提高粒重，具有显著的增产效应，为作物育种工作提供了新的水稻增产手段。手段。手段。

【技术实现步骤摘要】
用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，特别是涉及一种用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]水稻是全球近一半人口的主要粮食来源，如何从生物学角度持续提高水稻产量一直是作物科学研究领域的重点项目。在过去的几十年里，传统的育种方法为提高水稻产量发挥了巨大的作用，但随着世界人口的不断增长，迫切需要培育出对环境友好和节约资源的水稻品种，从而实现农业的可持续发展和粮食安全。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的现代分子育种，因其简单、高效和育种周期短等优势，正在掀起一场作物改良的浪潮。而开展现代分子育种的基础就是挖掘优质的重要性状基因，对其生物学功能和遗传效应进行深入研究。
[0003]CRISPR/Cas9基因编辑技术在水稻遗传改良中的重要应用主要包括：水稻产量、品质、抗除草剂和抗病虫害等方面。其中影响水稻产量的三要素分别是单株有效穗数、每穗实粒数和粒重。粒重(grain weight)是最可靠的指标，通常用千粒重(1000
‑
grain weight，TGW)表示。粒重主要由粒形(grain size)和充实度来决定的。而粒形是由粒长(grain length)、粒宽(grain width)和粒厚(grain thickness)决定的。粒长和粒宽也就成了产量育种的主要选择指标之一。目前，已报道的调节水稻粒长和粒宽的基因也有一些，包括GS3、GS5、GW2、GW5、GW7、GW8等，但这些对于作物育种工作还是远远不够的，不能实现粮食安全的安枕无忧。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用。
[0005]第一个方面，本申请提供了一种用于水稻粒增重的重组载体，基础质粒包括定点编辑的GS1；3基因组，所述定点编辑的GS1；3基因组包括gRNA序列碱基，所述gRNA序列碱基为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT。
[0006]第二个方面，本申请提供了一种用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，包括下列步骤：
[0007]CRISPR/Cas9靶位点的设计，通过基因网络工具定位GS1；3基因组的靶位点，得到定点编辑的GS1；3基因组；所述定点编辑的GS1；3基因组的gRNA序列碱基靶位点为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT；
[0008]CRISPR/Cas9载体的构建，以水稻pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3
‑
GS1；3
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sgRNA片段；
[0009]重组载体提取，将所述U3
‑
GS1；3
‑
sgRNA片段连接至pCXUN
‑
Cas9载体上，连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到克隆；提取克隆质粒，得到pCXUN
‑
Cas9
‑
GS1；3载体。
[0010]在第二个方面的某些实现方式中，所述CRISPR/Cas9载体的构建的步骤中，所述通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3
‑
GS1；3
‑
sgRNA片段的步骤包括：
[0011]以pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3
‑
gRNA
‑
F和U3
‑
R进行PCR扩增，得到第一PCR产物；
[0012]以pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3
‑
gRNA
‑
R和U3
‑
F进行PCR扩增，得到第二PCR产物；
[0013]将得到第一PCR产物和第二PCR产物混合，作为模板，以引物U3
‑
F和U3
‑
R进行PCR扩增，得到第三PCR产物；
[0014]将第三PCR产物进行纯化回收，得到所述U3
‑
GS1；3
‑
sgRNA片段。
[0015]结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，所述引物的基因序列为：
[0016]GS1；3
‑
gRNA
‑
F：AATTCAGGGTTGGTGGTACTgttttagagctagaaatagcaagtta；
[0017]GS1；3
‑
gRNA
‑
R：AGTACCACCAACCCTGAATTgccacggatcatctgcacaac；
[0018]以上序列所示大写字母为定点编辑后的GS1；3基因组的向导序列，小写字母为水稻pCRISPR
‑
U3质粒DNA的载体序列。
[0019]结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，所述U3
‑
R和所述U3
‑
F的基因序列为：
[0020]U3
‑
F：CCCCTTTCGCCAGGGGTACCGTAATTCATCCAGGTCTCCAAG；
[0021]U3
‑
R：TACGAATTCGAGCTCGGTACCGCTGTGCCGTACGACGGTACG。
[0022]第三个方面，本申请提供了一种用于水稻粒增重的重组菌的构建方法，采用如本申请第一个方面描述的重组载体，包括下列步骤：将所述重组载体通过热激法转化根癌农杆菌EHA105菌株，得到用于水稻粒增重的重组菌。
[0023]在第三个方面的某些实现方式中，所述将所述重组载体通过热激法转化根癌农杆菌EHA105菌株的步骤，包括：
[0024]从
‑
80℃的保存环境中取出农杆菌感受态细胞，融化后，加入所述重组载体，置冰上30min，得菌液；
[0025]将离心管放入液氮中速冻5min后放入37℃水中水浴5min，取出后迅速插入冰中2min，加入液体LB培养基，28℃下震荡培养3h；
[0026]吸取所述菌液均匀涂布在含有卡纳霉素和利福平的固体LB平板上，在28℃的培养箱中培养48h；
[0027]挑取单克隆于含有卡纳霉素和利福平的液体LB培养基中，在28℃下的摇床中培养24h。
[0028]第四个方面，本申请提供了一种用于水稻粒增重的重组载体在水稻稻粒增重中的应用。
[0029]本专利技术的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：
[0030]本专利技术提供的用于水稻粒增重的重组载体以GS1；3基因组为基础，利用基因工程技术手段对该基因组进行定向编辑，获得的转基因材料在不影响水稻正常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于水稻粒增重的重组载体，其特征在于，基础质粒包括定点编辑的GS1；3基因组，所述定点编辑的GS1；3基因组包括gRNA序列碱基靶位点，所述gRNA序列碱基靶位点为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT。2.一种用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：CRISPR/Cas9靶位点的设计，通过基因网络工具定位GS1；3基因组的靶位点，得到定点编辑的GS1；3基因组；所述定点编辑的GS1；3基因组的gRNA序列碱基靶位点为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT；CRISPR/Cas9载体的构建，以水稻pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3
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GS1；3
‑
sgRNA片段；重组载体提取，将所述U3
‑
GS1；3
‑
sgRNA片段连接至pCXUN
‑
Cas9载体上，连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到克隆；提取克隆质粒，得到pCXUN
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Cas9
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GS1；3载体。3.根据权利要求2所述的用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体的构建的步骤中，所述通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3
‑
GS1；3
‑
sgRNA片段的步骤包括：以pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3
‑
gRNA
‑
F和U3
‑
R进行PCR扩增，得到第一PCR产物；以pCRISPR
‑
U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3
‑
gRNA
‑
R和U3
‑
F进行PCR扩增，得到第二PCR产物；将得到第一PCR产物和第二PCR产物混合，作为模板，以引物U3
‑
F和U3
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊雨飞，徐得泽，翁晓敏，成烨，努尔加马丽，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院粮食作物研究所，
类型：发明
国别省市：