一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法；所述方法为降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平，其中降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平是通过RNA干扰（RNAi）实现的。通过这种方法获得的转基因柑橘的叶片接种溃疡细菌部位的病菌细胞的数量降低至现有野生型对照柑橘的16.9%，显著抑制了转基因柑橘中溃疡细菌入侵部位溃疡病菌的生长，提高了柑橘对溃疡病的抗性。对溃疡病的抗性。对溃疡病的抗性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

技术介绍

[0002]柑橘溃疡病是由地毯黄单胞杆菌引起的、发生在柑橘的病害。柑橘溃疡病是一种世界性病害，也是中国柑橘产区重要病害之一。目前为控制柑橘溃疡病危害通常采取化学防治为主，生物防治为辅的综合防治策略。由于以上防治措施对环境不友好，且需要投入大量的人力、物力，亟待通过培育抗病新品种来减少溃疡病带来的损失(陈力等，2008；朱雪梅等，2017)。利用基因工程的手段，在柑橘中超量表达抗菌肽基因（Peng et al.2015）、CsBZIP基因（Li et al.2019）和对柑橘体内的感病基因CsLOB1（Peng et al.2017）进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑，均获得了溃疡病抗性增强的转基因柑橘植株。
[0003]中国专利申请2022115636391公开了一种基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法，该方法为通过干扰RNA（RNAi）降低柑橘属植物中长链脂肪醇氧化酶CsFAO3基因的转录水平实现的。
[0004]该现有技术具有以下不足：该现有技术仅抑制了该转基因柑橘植株内受到溃疡病菌侵染的病菌，无法对抑制溃疡病菌最开始入侵部位的溃疡病菌的生长，无法从源头抑制溃疡病菌；且该现有技术中仅给出了离体后的叶片抑制溃疡病菌的生长效果，无法保证用于活体植株后是否抑制溃疡病菌生长效果还是如此。

技术实现思路

[0005]本专利技术为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。该方法是将CsEXPA8基因中372 bp的编码序列作为干扰序列，导入干扰载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法稳定整合到柑橘基因组中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，所述方法为降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平，其中降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平是通过RNA干扰（RNAi）实现的。
[0007]进一步地，所述方法包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsEXPA8的干扰序列；(2)进行包含所述干扰序列的CsEXPA8干扰表达载体构建；(3)CsEXPA8干扰表达载体转化柑橘得到转基因柑橘植株。
[0008]进一步地，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]进一步地，步骤(1)中，所述干扰序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用PCR扩增得到干扰序列。
[0010]进一步地，所述PCR扩增所采用的引物为rCsEXPA8
‑
F和rCsEXPA8
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0011]进一步地，步骤(2)中，CsEXPA8干扰表达载体构建方法为：A. 构建出正向干扰序列载体：利用AscI和SwaI分别双酶切pUC
‑
RNAi载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的pUC
‑
RNAi载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接；B．构建CsEXPA8干扰表达载体：将步骤A得到的正向干扰序列载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体再分别利用XbaI和BamHI进行双酶切，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的正向干扰序列载体大片段和干扰序列片段连接，获得同时包含正向和反向干扰序列片段的pUC
‑
RNAi
‑
CsEXPA8干扰载体；最后，利用KpnI和SalI分别双酶切所述pUC
‑
RNAi
‑
CsEXPA8干扰载体和pLGNe载体，利用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的所述正向和反向干扰序列片段和线性化的pLGNe载体连接。
[0012]进一步地，步骤(3)中，用所述CsEXPA8干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过冻融法将所述CsEXPA8干扰表达载体导入农杆菌菌株EHA105中，再用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴茎段，经离体培养后、染色鉴定和嫁接得到转基因柑橘植株。
[0013]进一步地，步骤(3)得到转基因柑橘植株后，对转基因柑橘植株进行抗性评价，通过活体植株接种溃疡病菌，判定活体植株中CsEXPA8基因干扰与柑橘溃疡病抗性的相关性。
[0014]进一步地，对转基因柑橘植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因柑橘植株，采用的引物为GUS
‑
F和GUS
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
[0015]进一步地，PCR验证后，用qRT
‑
PCR验证转基因柑橘植株中CsEXPA8基因的转录水平，检测所采用的引物为qCsEXPA8
‑
f和qCsEXPA8
‑
r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；内参基因为柑橘Actin基因，采用引物为Actin
‑
F和Actin
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。通过这种方法获得的转基因柑橘的活体叶片接种溃疡细菌部位的病菌细胞的数量降低至现有野生型对照柑橘的16.9%，显著抑制了转基因柑橘中溃疡细菌入侵部位溃疡病菌的生长，提高了柑橘对溃疡病的抗性。
[0017]本专利技术利用的CsEXPA8基因是一种扩增蛋白基因，已知的功能仅仅是一类引起细胞壁松驰和细胞壁柔韧性增加的蛋白，而对植物特别是对柑橘品质和性能的影响并无深入研究。通过干扰这个基因的表达，在大大提高柑橘对溃疡病的抗性的同时，最大程度上减少了对柑橘已知品质和性能的不良影响，开辟了柑橘抗溃疡病育种的另外一条途径，促进了柑橘抗溃疡病育种的发展。
附图说明
[0018]图1提供了本专利技术所述CsEXPA8干扰表达载体的构建示意图。
[0019]图2提供了转基因植株中CsEXPA8基因的相对表达水平。其中WT代表野生型植株，RNAi
‑
5和RNAi
‑
6分别代表含有本专利技术所述干扰序列的其中两株转基因植株编号。含有本专利技术所述干扰序列的转基因植株中CsEXPA8基因的表达水平与野生型植株相比显著降低，而
转基因植株本身之间的差异不明显。
[0020]图3提供了干扰CsEXPA8表达的转基因植株活体接种溃疡病菌12d后的发病情况。其中WT代表野生型植株，RNAi
‑
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：所述方法为降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平，其中降低柑橘属植物中CsEXPA8基因的转录水平是通过RNA干扰（RNAi）实现的。2.根据权利要求1所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsEXPA8的干扰序列；(2)进行包含干扰序列的CsEXPA8干扰表达载体构建；(3)CsEXPA8干扰表达载体转化柑橘得到转基因柑橘植株。3.根据权利要求2所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求2或3所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述干扰序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用PCR扩增得到干扰序列。5.根据权利要求4所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：所述PCR扩增所采用的引物为rCsEXPA8
‑
F和rCsEXPA8
‑
R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。6.根据权利要求2
‑
5任一所述的利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：步骤(2)中，CsEXPA8干扰表达载体构建方法为：A．构建出正向干扰序列载体：利用AscI和SwaI分别双酶切pUC
‑
RNAi载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的pUC
‑
RNAi载体大片段和所述干扰序列的酶切片段连接；B．构建CsEXPA8干扰表达载体：将步骤A得到的正向干扰序列载体和含有所述干扰序列的T
‑
克隆载体再分别利用XbaI和BamHI进行双酶切，用T4
‑
DNA连接酶将酶切后的正向干扰序列载体大片段和干扰序列片段连接，获得同时包含正向和反向干扰序列片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭爱红，张婧芸，陈志毅，何永睿，姚利晓，雷天刚，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：