一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种生产L

【技术实现步骤摘要】
一种生产L
‑
岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及一种生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]L
‑
岩藻糖(6
‑
脱氧
‑
L
‑
半乳糖)是一种广泛存在于植物、细菌和动物体内的单糖，在自然界中主要以多糖的形式存在。褐藻、海草和棘皮动物体内存在一类富含岩藻糖的硫酸盐碳水化合物，称为岩藻聚糖。L
‑
岩藻糖是细菌胞外多糖(EPS)的主要成分，在哺乳动物细胞中存在许多N
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和O
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连接聚糖和糖脂的岩藻糖基末端修饰。岩藻糖和其他己糖之间的结构差异在于6位碳上缺少羟基。L
‑
岩藻糖和含岩藻糖的分子，如岩藻糖基低聚糖和岩藻多糖，具有生物活性并发挥独特的生理功能。单糖岩藻糖可以作为细菌的能量来源、粘附位点或毒力因子。在人类宿主中，许多抗体是针对含岩藻糖的聚糖基序的，它可以影响免疫反应的结果，保护宿主免受感染和炎症。岩藻糖基低聚糖在已鉴定的母乳低聚糖(HMO)中所占比例最大，对婴儿的生长和健康至关重要。例如2
’‑
岩藻糖基乳糖具有抑制病原菌、预防过敏性疾病、促进益生菌生长、促进婴儿免疫系统和大脑发育等生理功能。此外，岩藻多糖通过抑制病毒附着、进入和复制，对一系列呼吸道病毒具有抑制作用。
[0003]L
‑
岩藻糖可通过酸解从褐藻中提取，或通过酶解富含岩藻糖的微生物胞外多糖提取，这些水解方法需要从糖混合物中纯化岩藻糖。一些异构己糖也可以通过化学方法转化为L
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岩藻糖。然而，这些L
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岩藻糖生产方法存在环境不友好或不经济的缺陷，同时限制了应用场景。因此，在经典的工程微生物中设计和构建人工合成途径，从可持续碳源中生产L
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岩藻糖是一种高效且环保的方法。作为GRAS(Generally Regarded As Safe)菌种，枯草芽孢杆菌不产致热源、内毒素，无毒副作用，可以减轻后续的分离纯化成本，适合用来生产L
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岩藻糖。目前还没有实现利用枯草芽孢杆菌进行L
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岩藻糖从头合成的技术或报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，从而解决现有技术中L
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岩藻糖的生产方法存在经济效益低、环境不友好的问题。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]根据本专利技术的第一方面，提供一种生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：1)在枯草芽孢杆菌基因组nprE位点整合PmtlA启动子调控的编码转化转录因子comK的基因序列；消除抗性基因后，在aprE位点整合含有P43启动子调控的T7 RNA聚合酶基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164MCT；2)在步骤1)获得的重组枯草芽孢杆菌BS164MCT基础上，在srfAA位点整合T7启动子控制的编码果糖6
‑
磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷基转移酶的基因片段；消除抗性基因后，在bacA位点整合T7启动子控制的编码GDP
‑
甘露糖脱水酶、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶的基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164GF；3)克隆来自于大肠埃希氏菌K
‑
12或其衍生菌株的GDP
‑
D
‑
甘露糖水解酶基因及
其突变体到表达载体pMK4，构建T7启动子控制的高效表达质粒pMK4
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T7
‑
WcaH；4)将步骤3)构建得到的高效表达质粒pMK4
‑
T7
‑
WcaH转化步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF，获得一种生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164GF
‑
pW；5)在步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF基础上，在rocD位点整合T7启动子控制的编码GDP
‑
D
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甘露糖水解酶的基因片段，获得另一种生产L
‑
岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164FU。
[0007]作为优选实施方案，所述编码转化转录因子comK的基因序列由甘露醇诱导启动子PmtlA控制，所述编码转化转录因子comK的基因序列是SEQ ID NO:1所示的序列，或者是与SEQ ID NO:1具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码T7 RNA聚合酶基因由T7启动子控制，所述编码T7 RNA聚合酶的融合基因片段是SEQ ID NO:2所示的序列，或者是与SEQ ID NO:2具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。
[0008]作为优选实施方案，所述编码果糖6
‑
磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO:3所示的序列，或者是与SEQ ID NO:3具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码GDP
‑
甘露糖脱水酶、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶融合基因片段是SEQ ID NO:4所示的序列，或者是与SEQ ID NO:4具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。
[0009]作为优选实施方案，所述pMK4
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T7
‑
WcaH为高效表达质粒载体，克隆了一个来自于大肠埃希氏菌K
‑
12或其衍生菌株的GDP
‑
D
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甘露糖水解酶的基因到表达载体pMK4，所述pMK4
‑
T7
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WcaH的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，或者是与SEQ ID NO:5具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。
[0010]作为优选实施方案，所述生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164FU，编码GDP
‑
D
‑
甘露糖水解酶的融合基因片段是SEQ ID NO:6所示的序列，或者是与SEQ ID NO:6具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。
[0011]根据本专利技术的一个优选方案，所述PmtlAcomk基因、P43 T7 RNAP基因、T7
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manA
‑
manB
‑
manC基因、T7
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gmd
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wcaG基因、pMK4
‑
T7
‑
WcaH质粒、GDP
‑
D
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产L
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岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在枯草芽孢杆菌基因组nprE位点整合PmtlA启动子调控的编码转化转录因子comK的基因序列；消除抗性基因后，在aprE位点整合含有P43启动子调控的T7 RNA聚合酶基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164MCT；2)在步骤1)获得的重组枯草芽孢杆菌BS164MCT基础上，在srfAA位点整合T7启动子控制的编码果糖6
‑
磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷基转移酶的基因片段；消除抗性基因后，在bacA位点整合T7启动子控制的编码GDP
‑
甘露糖脱水酶、GDP
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L
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岩藻糖合成酶的基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164GF；3)克隆来自于大肠埃希氏菌K
‑
12或其衍生菌株的GDP
‑
D
‑
甘露糖水解酶基因或其突变体到表达载体pMK4，构建T7启动子控制的高效表达质粒pMK4
‑
T7
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WcaH；4)将步骤3)构建得到的高效表达质粒pMK4
‑
T7
‑
WcaH转化步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF，获得一种生产L
‑
岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164GF
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pW；5)在步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF基础上，在rocD位点整合T7启动子控制的编码GDP
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D
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甘露糖水解酶的基因片段，获得另一种生产L
‑
岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164FU。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述编码转化转录因子的comk基因由甘露醇诱导启动子PmtlA控制，所述编码转化转录因子的comk基因是SEQ IDNO:1所示的序列，或者是与SEQ ID NO:1具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码T7 RNA聚合酶的基因由T7启动子控制，所述编码T7 RNA聚合酶的基因是SEQ ID NO:2所示的序列，或者是与SEQ ID NO:2具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述果糖6
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磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷基转移酶的基因是SEQ ID NO:3所示的序列，或者是与SEQ ID NO:3具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码GDP
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甘露糖脱水酶、GDP
‑
L
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岩藻糖合成酶的基因是SEQ ID NO:4所示的序列，或者是与SEQ IDNO:4具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效表达质粒载体pMK4
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T7
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WcaH通过克隆一个来自于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊松，伏聪，谢雨康，史吉平，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：