一种特利加压素中氨基酸组成分析的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种特利加压素中氨基酸组成分析的测定方法，该方法采用盐酸水解并结合高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种特利加压素中氨基酸组成分析的测定方法


[0001]本专利技术涉及采用酸水解法并结合高效液相色谱
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CAD检测器分析特利加压素中氨基酸组成。此方法能较好的控制原料药及制剂中氨基酸组成含量，为患者的健康安全用药提供保障，属于医药

技术背景
[0002]特利加压素，化学名Terlipressin。
[0003]人体的垂体后叶分泌内源性的加压素，特利加压素为加压素的合成类似物，使用赖氨酸替代了内源性加压素肽链中第八位的精氨酸，同时在半胱氨酸增加了由三个甘氨酸组成的氨基酸支链。特利加压素进入体内后，经过酶的裂解作用，代谢为活性产物起到药理作用。其主要作用为缩血管和抗出血。使用特利加压素后，内脏区域的血流量明显下降，导致肝脏的血流量和门静脉压下降。药效学的研究结果表明，特利加压素与其它类似的肽一样可导致动脉、静脉和内脏区域的小静脉产生收缩，可导致食道壁平滑肌的收缩，同时增加整个小肠的蠕动和肠鸣音。除了对血管平滑肌的作用外，特利加压素还可以作用于子宫的平滑肌引起子宫运动增加，该活性不因患者妊娠与否而改变。动物和人体的实验数据显示特利加压素的主要作用部位为内脏区域和皮肤。特利加压素还具有抗出血性休克、内毒素和组胺性休克的作用。目前，还没有详细的数据显示本品有抗利尿作用特利加压素。
[0004]结构如下：
[0005][0006]本品系合成的十二肽。为L
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甘氨酰
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L
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甘氨酰
‑
L
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甘氨酰
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L
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半胱氨酰
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L
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酪氨酰
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L
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苯丙氨酰
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L
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谷氨酰氨酰
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L
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天冬酰氨酰
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L
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半胱氨酰
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L
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脯氨酰
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L
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赖氨酰
‑
L
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甘氨酰胺醋酸盐(4
→9‑
二硫环)。其结构组成如下：
[0007][0008]准确定量地测定特利加压素中氨基酸组成含量极具挑战性。很难采用气相、液相色谱等对其进行直接定量分析。
[0009]由于氨基酸的两性特征，其极性较大，多数无紫外共轭吸收官能团，常规的色谱分析无法直接进行定量测定。
[0010]目前，测定特利加压素及相关肽类中氨基酸组成的分析方法多采用水解并结合化学衍生法对其分析检测，此类方法操作繁琐，重现性差，无法满足对多肽中各氨基酸组成的分析要求，不能提供可靠的分析结果。为了克服现有分析方法的缺陷，本专利技术采用盐酸水解并结合高效液相色谱
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CAD检测器直接测定特利加压素中氨基酸组成的含量，无需衍生处理。该分析方法具有操作简单、专属性强、准确性高、重现性好等特点。

技术实现思路

[0011]如上所述，直接准确定量测定氨基酸组成存在各种缺陷。利用氨基酸具有两性特征，其羧基和氨基均是强氢键供体，而且极性相对较大。因此，挑选具有强疏水特征和强氢键受体的十八烷基键合五氟苯基键合硅胶的反相色谱柱；同样考虑到氨基酸的氨基基团在酸性水溶液环境中极易形成离子对的特性，采用可挥发性的强离子对酸性试剂——七氟丁酸作为流动相添加剂，增强极性氨基酸在反相色谱中的疏水保留，以达到对各个游离氨基酸进行分离的目的。
[0012]鉴于多数氨基酸无紫外共轭吸收官能团，但其具有分子内盐的特征，沸点高，不易挥发。因此，非常适合采用电喷雾检测器——CAD进行检测分析。
[0013]本专利技术即采用盐酸水解并结合高效液相色谱
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CAD检测器直接测定特利加压素中氨基酸组成的含量，无需衍生处理。该分析方法具有操作简单、专属性强、准确性高、重现性好等特点。
[0014]通过试验发现特利加压素及氨基酸在纯水、酸水中有非常好的溶解性。本专利技术将采用七氟丁酸与水按一定比例混合作为稀释剂，既起到离子对试液的目的，又能很好的溶解样品。
[0015]本专利技术涉及一种特利加压素中氨基酸组成含量的测定分析方法，该方法为盐酸水解并结合高效液相色谱
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CAD检测器直接测定特利加压素中氨基酸组成的含量。
[0016]该方法包括以下几个步骤：
[0017]一、稀释液的准备
[0018]稀释液A：准确量取100mL浓盐酸至100mL水中，添加1g的苯酚，超声，混匀。
[0019]稀释液B：准确称取115.5mg的醋酸铵至100mL水中，溶解，混匀。
[0020]稀释液C：准确量取100mL浓盐酸，添加1g的苯酚，超声，混匀。
[0021]稀释液D：0.1％
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0.4％七氟丁酸水溶液。
[0022]二、操作步骤
[0023](1)准确称取10mg醋酸特利加压素原料，6mg二硫苏糖醇(DTT)至5mL EP管中，准确移取1.0mL稀释液B，超声溶解，混匀，静置1h；再向上述EP管中加入18μL的4
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乙烯吡啶(4
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VP)摇匀，超声30秒，室温下静置0.5h；准确移取1.0mL稀释液C至该溶液中，摇匀；再准确移取0.2mL上述溶液至20mL顶空瓶中，压盖封紧瓶口，将顶空瓶放置110℃烘箱20h，取出顶空瓶，冷却至室温后，用氮气将溶液吹干。准确移取2mL稀释液D至上述顶空瓶中，混匀超声1分
钟，过滤，取续滤液制备得到供试品溶液；
[0024](2)采用十八烷基键合五氟苯基键合硅胶色谱柱，流动相A：为0.1％
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0.4％七氟丁酸水溶液，流动相B：0.05
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0.3％七氟丁酸甲醇溶液，进行梯度洗脱。
[0025](3)设置流动相流速为0.5
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2.0mL/min，柱温控制在25
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50℃。
[0026](4)设置CAD温度为30
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60℃。
[0027](5)取步骤(1)的供试品溶液15μL，进样，记录CAD图谱。
[0028](6)采用CAD检测器，取(1)的供试品溶液进样，记录CAD图谱。
[0029]本专利技术采用的技术方案如下：
[0030]稀释液的准备：
[0031]稀释液A：准确量取100mL浓盐酸至100mL水中，添加1g的苯酚，超声，混匀
[0032]稀释液B：准确称取115.5mg的醋酸铵至100mL水中，溶解，混匀。
[0033]稀释液C：准确量取100mL浓盐酸，添加1g的苯酚，超声，混匀。
[0034]稀释液D：0.1％
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0.4％七氟丁酸水溶液。
[0035]样品和对照品配制：
[0036]氨基酸标准溶液：
[0037]储备液A(1mg/mL)：准确称取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特利加压素中氨基酸组成分析的测定方法，其特征在于采用盐酸水解并结合高效液相色谱
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CAD检测器测定特利加压素中氨基酸组成的含量。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于采用盐酸水解并结合高效液相色谱
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CAD检测器，无需衍生，直接测定各个氨基酸的含量。3.根据权利要求1所述，其特征在于该方法包括以下几个步骤：(1)准确称取10mg醋酸特利加压素原料，6mg二硫苏糖醇(DTT)至5mLEP管中，准确移取1.0mL稀释液B，超声溶解，混匀，静置1h；再向上述EP管中加入18μL的4
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乙烯吡啶(4
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VP)摇匀，超声30秒，室温下静置0.5h；准确移取1.0mL稀释液C至该溶液中，摇匀；再准确移取0.2mL上述溶液至2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽娟，祝广山，胡素招，袁然，安建国，顾虹，
申请(专利权)人：上海奥博生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：