一种裂解性噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种裂解性噬菌体ΦPB10334T及其在防控烟草青枯病中的应用，属于微生物技术领域。该噬菌体的分类命名为Podoviridaesp.ΦPB10334T，于2022年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20221887，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明专利技术提供的噬菌体具有繁殖迅速，效价高，保存时间长的优点，在防控烟草青枯病的应用中存在明显的优势。本发明专利技术还公开了采用蘸根法将噬菌体吸附于烟草根部，噬菌体只能侵染青枯菌，在防控烟草青枯病的同时降低了对土壤中土著微生物群落的扰动，具有广阔的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种裂解性噬菌体及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，更具体地说是涉及一种裂解性噬菌体ΦPB10334T及其在防控烟草青枯病中的应用。

技术介绍

[0002]烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌，R.solanacearum)侵染引起的系统性病害，多发于我国烟草种植地区，可导致烟草发生不可逆的萎蔫，发病严重时会导致整株死亡，造成烟草严重减产，制约着烟草经济的发展。
[0003]目前，在烟草生产中尽管采用种植抗性品种、合理轮作、化学防控、拮抗菌剂、合理的栽培措施等综合措施加以防治，但在实际生产中，这些方法并不总是能有效地控制烟草青枯病的发生，而且由于受到免疫青枯病烟草品种缺失，轮作条件限制等因素，烟草青枯病依然是烟叶生产过程中的主要病害之一，存在难以有效防控等问题。
[0004]噬菌体是一种专性侵染细菌的病毒，自然界中普遍存在。裂解性噬菌体侵染细菌后会裂解宿主细胞，影响细菌的新陈代谢，有效控制宿主细菌的数量。利用噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的治疗手段称为噬菌体疗法。由于噬菌体是专一感染对其敏感的宿主，而对周围的其它菌群不会有破坏作用，因此噬菌体疗法作为传统药物疗法的替代备选被寄予厚望，也成为了研究热点之一。
[0005]虽然通过噬菌体裂解病原菌来防控烟草青枯病害具有广阔的应用前景，但是，青枯菌种性复杂，种内具有多个生理小种、生化型、演化型；青枯菌变异多样，不同生理小种在环境中有较强的变异性。因此，提供新型、高效的裂解烟草青枯病菌的噬菌体是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种裂解性噬菌体及其在防控烟草青枯病中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种裂解性烟草青枯菌噬菌体(Podoviridae sp.)ΦPB10334T，于2022年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20221887，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名为Podoviridaesp.ΦPB10334T。该噬菌体具有繁殖迅速，效价高，保存时间长的优点。
[0009]本专利技术的另一目的是提供上述裂解性噬菌体ΦPB10334T在制备防控烟草青枯病制剂中的应用。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供一种防控烟草青枯病的制剂，所述制剂中包含本专利技术所述的裂解性噬菌体ΦPB10334T。
[0011]优选的，所述制剂中裂解性噬菌体ΦPB10334T的含量为1
×
107‑1×
108PFU/mL。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供一种防控烟草青枯病的方法，将本专利技术所述的制剂采用蘸根法吸附于烟草根部，且时间为移栽前。
[0013]优选的，所述制剂的吸附量为3
‑
5ml/株。
[0014]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一株裂解性烟草青枯菌噬菌体ΦPB10334T，该噬菌体具有繁殖迅速，效价高，保存时间长的优点，本专利技术采用蘸根法在烟草幼苗移栽前，将噬菌体吸附于烟草根部，不仅节省了用工，而且噬菌体只能侵染青枯菌，在防控烟草青枯病的同时降低了对土壤中土著微生物群落的扰动。噬菌体ΦPB10334T属于肌尾噬菌体科，最佳感染复数(MOI)为0.01，还可以有效抑制除宿主菌之外的部分烟草青枯菌的生长；田间实验效果也表明其可以有效降低烟草青枯病的发病率和病情指数，具有广阔的前景。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0016]图1为噬菌体ΦPB10334T的噬菌斑形态图；
[0017]图2为噬菌体ΦPB10334T的电镜形态图；
[0018]图3为噬菌体ΦPB10334T的一步生长曲线图；
[0019]图4为噬菌体ΦPB10334T菌剂防控青枯病效果图。
具体实施方式
[0020]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细阐述，其中如无特殊说明，实施例中涉及的试剂均可以通过商业渠道采购，未提及的方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
[0022]本专利技术所采用的青枯菌菌Rs TZ、Rs AL、Rs ZP、Rs TZ、Rs MJ和Rs FXC菌株均由贵州省烟草科学研究院从贵州省烟草烟区分离获得。
[0023]实施例1裂解性烟草青枯菌噬菌体的筛选
[0024]取贵州省黔东南州天柱县平甫村采集的土壤样品1g，加入5ml纯净水，充分混匀后，离心取上清液，通过0.22μm孔径的滤器获得过滤液。采用青枯菌共培养的方法筛选和纯化噬菌体，具体做法：取上述土壤滤液20μl与100μl的浓度为1
×
107cfu/ml的Rs TZ青枯菌液混合均匀后，涂布于CPG固体培养基上，在28℃下共同培养16
‑
20h，定期观察，直至形成透明噬菌斑，用灭过菌的牙签轻轻接触噬菌斑，然后放入30μL的无菌水中，获得一株裂解性的烟草青枯菌菌噬菌体，见图1。
[0025]CPG培养基：酪蛋白氨基酸/酪蛋白水解物1.0g；蛋白胨10g；蔗糖5.0g；蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃，灭菌15min；CPG固体培养基，在液体CPG培养基中加1.5g/100ml的琼脂糖粉，倒平板凝固后使用。
301.80
×
1051351.50
×
108451.60
×
1061501.60
×
108601.00
×
1071651.80
×
108751.20
×
1071801.85
×
108902.30
×
1071951.86
×
108[0038]由图3和表2可知：在培养45min左右，噬菌体ΦPB10334T子代进入快速增长期，说明该噬菌体能迅速侵染宿主并繁殖子代。
[0039]实施例5噬菌体ΦPB10334T的保存时间的测定
[0040]将等体积的初始浓度为3.0
×
109pfu/ml的噬菌体ΦPB10334T溶液，分别在常温(25℃)和低温(
‑
20℃和4℃)下进性保存，1
‑
3个月，测定噬菌体的含量(pfu/ml)，结果如表3所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂解性噬菌体(Podoviridaesp.)，其特征于，命名为ΦPB10334T，分类命名为Podoviridaesp.ΦPB10334T，于2022年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20221887，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。2.如权利要求1所述的裂解性噬菌体在制备防控烟草青枯病制剂中的应用。3.一种防控烟草青枯病的制剂，其特征在于，所述制剂中包含权利要求1所述的噬菌体ΦPB1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡刘体，汪汉成，陆宁，陈兴江，杨颜，唐军，顾永丽，梁亨武，杨通隆，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：