一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒。复合扩增体系包括如SEQ ID NO.1～48所示的引物序列，可同时扩增如下STR位点：HBB、HBA、PPBP、HBD、ALAS2、AMI、PRM1、MSMB、KLK3、SEMG1、KLK2、PRM2、HTN3、STATH、MUC7、KRT13、KRT4、SPRR2A、MYOZ1、HBD1、CYP2B7P、β2

【技术实现步骤摘要】
一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒


[0001]本专利技术属于法医学检测鉴定
，具体涉及一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒。

技术介绍

[0002]近十多年来，在法医学领域DNA分析技术有助于在罪犯和作案现场之间找到关联证据，缩小嫌犯范围，尽管DNA分析方法作为鉴定刑事案件的重要辅助手段已经得到普遍认可，但由于案件形式的多样化，仅靠DNA的检验方法已不能满足所有刑事案件的需要。而正确识别现场生物检材的组织来源有助于推断案件的发生过程及现场重建，DNA的STR分型检测技术可判定常见的生物检材如唾液、血液和精液等的个体来源，但因DNA的同一性，依靠现有DNA检测试剂盒无法区分来自同一个体的不同体液类型。
[0003]不同组织和体液均含有其独特的蛋白或酶分子。传统的法医物证学主要通过一些酶促反应或免疫学试验检测这些特定蛋白分子，从而筛选和确证各种体液和组织。这些传统鉴定方法通常比较简便、快速，对血痕、精斑等少数体液组织具有较高的特异性和准确性，但亦存在一定局限。首先，部分体液和组织间存在交叉反应，使其特异性降低；其次，传统鉴定方法会对检材造成破坏，且不同组织鉴定方法难以兼容，故需消耗额外的检材，这对量少的生物检材极为不利；再次，因酶蛋白不及DNA稳定，致使陈旧或腐败降解检材检测困难。此外，传统方法结果判定大多依赖操作者的水平和经验，增加了人为因素造成误判的风险。
[0004]目前，法医学对组织来源鉴定广泛使用的分子标志主要有信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微RNA(MicroRNA，miRNA)、DNA甲基化三种；此外，微生物菌群也可用于体液来源鉴定。因此针对体液斑类型的检测主要有下列几种方法：
[0005]1.微小RNA分析法
[0006]微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类内源性的非编码小分子RNA，长度范围在16
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29nt，平均长度22nt，广泛存在于各种真核细胞中。miRNAs通过直接剪切靶mRNA，或者通过完全/不完全与靶mRNAs3'非翻译区互补结合抑制靶mRNA的翻译，从而参与调节细胞生长发育、分化、凋亡、衰老、疾病及肿瘤的发生，被誉为基因表达的“调节器”。现已证实，不同体液和组织间miRNAs表达存在差异，致使miRNAs成为法医学组织来源鉴定新的分子工具。
[0007]有研究显示，miRNAs不仅能抵抗RNA酶的降解，而且在加入强酸、强碱或温度极端改变时，其含量和分子结构亦无明显改变，加之miRNAs分子很小，因此与采用mRNA进行组织/体液鉴定相比，miRNAs检测的最大优势是灵敏度和稳定性更高。但应注意的是，miRNA的表达是相对表达，其检测依赖RT
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PCR，结果难以标准化。
[0008]2.组织差异性甲基化分析法
[0009]大量研究证实，哺乳动物不同组织间存在众多的组织特异性差异甲基化区(tissuespecific differentially methylated regions，tDMRs)，由此赋予各种细胞和组
NO.1～48所示的引物序列，可同时扩增如下STR位点：
[0018]HBB、HBA、PPBP、HBD、ALAS2、AMI、PRM1、MSMB、KLK3、SEMG1、KLK2、PRM2、HTN3、STATH、MUC7、KRT13、KRT4、SPRR2A、MYOZ1、HBD1、CYP2B7P、β2
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MG、UBC以及PGK；具体位点和扩增引物信息如表1所示：
[0019]表1位点和扩增引物
[0020][0021][0022]本专利技术通过特征标记物的表达趋势和特异性研究，选择的24个位点包含血液的6位点AMI、PPBP、ALAS2、HBD、HBB和HBA；精液的6个位点PRM1、PRM2、MSMB、KLK3、SEMG1和KLK2；
唾液的6个位点HTN3、STATH、MUC7、KRT4、KRT13和SPRR2A；阴道分泌物的3个位点MYOZ1、HBD1、CYP2B7P；管家基因的3个位点β2
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MG、UBC、PGK。这些体液斑位点特异性好，管家基因在各种类型的体液斑中表达稳定。
[0023]进一步地，引物对的5
’
端进行荧光标记，荧光标记分别为FAM、HEX、TAMRA和ROX。
[0024]进一步地，将上述24个位点分为四组，其中，第一组为CYP2B7P、HBD1、MYOZ1、β2
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MG、UBC和PGK，扩增CYP2B7P、HBD1、MYOZ1、β2
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MG、UBC和PGK位点的引物对的荧光标记为FAM；
[0025]第二组为HTN3、STATH、MUC7、KRT4、KRT13和SPRR2A，扩增HTN3、STATH、MUC7、KRT4、KRT13和SPRR2A位点的引物对的荧光标记为HEX；
[0026]第三组为PRM1、PRM2、MSMB、KLK3、SEMG1和KLK2，扩增PRM1、PRM2、MSMB、KLK3、SEMG1和KLK2位点的引物对的荧光标记为TAMRA；
[0027]第四组为AMI、PPBP、ALAS2、HBD、HBB和HBA，扩增AMI、PPBP、ALAS2、HBD、HBB和HBA位点的引物对的荧光标记为ROX。
[0028]进一步地，混合体液包括血液、唾液、精液和阴道分泌物中的至少一种。
[0029]一种用于扩增上述复合扩增体系的引物组合，引物组合包括如SEQ ID NO.1～48所示的序列。
[0030]本专利技术采用四色荧光标记系统，将上述的24个基因座分组并进行荧光标记：FAM标记MYOZ1、HBD1、CYP2B7P、β2
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MG、UBC和PGK；HEX标记HTN3、STATH、MUC7、KRT4、KRT13和SPRR2A；TAMRA标记PRM1、PRM2、MSMB、KLK3、SEMG1和KLK2；R0X标记AMI、PPBP、ALAS2、HBD、HBB和HBA。
[0031]同时，在设计mRNA引物时，要求引物其中一条至少跨越一个外显子
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外显子连接区，以确保引物不会和DNA结合，确保mRNA产物的特异性。根据筛选位点产物长度构建复合体系，要求不同荧光修饰的位点互相间隔，保证位点间不会互相影响。将所有引物混合进行复合扩增实验，确定无非特异扩增的现象。同时本专利技术的检测组分中标准物采用Orange标记，能够很明确的标记区分出各个位点扩增产物的大小。
[0032]一种用于对混合体液进行鉴定的试剂盒，试剂盒包括权利要求5所述的引物组合。
[0033]进一步地，还包括缓冲液、模板cDNA和Taq DNA聚合酶。
[0034]进一步地，PCR缓冲液成分包括：l0mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，50mM的pH8.3的Tris
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HCl，2mM的镁离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系包括如SEQ ID NO.1～48所示的引物序列，可同时扩增如下STR位点：HBB、HBA、PPBP、HBD、ALAS2、AMI、PRM1、MSMB、KLK3、SEMG1、KLK2、PRM2、HTN3、STATH、MUC7、KRT13、KRT4、SPRR2A、MYOZ1、HBD1、CYP2B7P、β2
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MG、UBC以及PGK。2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，引物对的5
’
端进行荧光标记，荧光标记分别为FAM、HEX、TAMRA和ROX。3.根据权利要求2所述的复合扩增体系，其特征在于，扩增CYP2B7P、HBD1、MYOZ1、β2
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MG、UBC和PGK位点的引物对的荧光标记为FAM；扩增HTN3、STATH、MUC7、KRT4、KRT13和SPRR2A位点的引物对的荧光标记为HEX；扩增PRM1、PRM2、MSMB、KLK3、SEMG1和KL...

【专利技术属性】
技术研发人员：高知枭，梁伟波，肖园园，屈胜秋，陈德智，刘桂宏，郑亚子，吴秋硕，于在亮，李迎澳，陈初光，
申请(专利权)人：苏州阅微基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：