一种与绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用。本发明专利技术利用DNA混池测序结合KASPar技术检测湖羊PLEKHH2基因SNP位点的方法。根据PLEKHH2基因序列设计引物，从绵羊血液中提取DNA，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，发现在扩增片段的第368位存在一个C/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对889只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与免疫性状指标进行关联分析，发现该位点与绵羊的血小板数(PLT)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)呈显著相关。通过检测本发明专利技术的分子标记，可用于绵羊的标记辅助抗病育种上，加速绵羊育种进程。绵羊育种进程。

【技术实现步骤摘要】
一种与绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于绵羊分子标记筛选与应用
，具体涉及PLEKHH2基因多态性作为影响绵羊免疫性状的分子标记、其检测方法和应用。

技术介绍

[0002]在养羊生产中，疾病不仅会导致绵羊生产力下降，还可能导致大量绵羊死亡，给养羊业造成巨大的经济损失。目前，在全球禁用抗生素的背景下，疾病控制的主要手段仍然依赖于疫苗接种和药物治疗，但这些措施并不能完全解决绵羊病的问题，大量使用药物可能导致耐药性的发展，并且还可能因药物残留而给畜产品的质量和安全带来潜在的风险(Ahmed et al.2020；伊拉米奥特等人，2020)。此外，集约化、大规模养殖的绵羊比例越来越大，对羊在拥挤的饲养管理条件下的抗病性提出了更高的要求。因此，迫切需要从基因育种措施来从根本上增强绵羊的抗病性，但是在直接进行抗病性方面仍存在许多困难，这可以通过选择免疫指标来间接改善，并且随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(marker
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assisted selection，MAS)被广泛应用于畜禽的选种选育工作中。
[0003]绵羊作为主要的草食动物，其抗病育种工作也越来越被重视，其中哺乳动物的血液学特征由三个组成部分组成：白细胞，红细胞和血小板，它们是动物免疫功能，抗病性和整体健康的重要指标(Dal Colletto等人，1993)(Wang等人，2022)。了解这些性状的遗传背景控制变异将有助于疾病检测、种质利用和育种改进。迄今为止，对血液学参数的候选基因和数量性状位点(QTL)的研究仅限于人类(Vasquez等人，2016)和一些重要的农场动物，包括猪(Bovo等人，2019；赵等人，2011；荣格等人，2014；罗等人，2012)，牛(栗鼠
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巴尔加斯等人，2020年；Hu等人，2019)和家禽(Sun等人，2016)。然而，与绵羊血液学性状研究相关的候选基因和QTL仍处于萌芽阶段。
[0004]PLEKHH2是G蛋白偶联受体信号通路中的一种细胞质蛋白，在肾小球足细胞中高度富集，并与几种人类免疫疾病的发展有关，例如糖尿病肾病(DN)(Greene等人，2008)和局灶性节段性肾小球硬化症(Perisic等人，2012)。有趣的是，PLEKHH2也被确定为在健康和精神分裂症患者的外周组织成纤维细胞中差异表达(Etemadikhah等人，2020)。然而，在农场动物中，还没有报道PLEKHH2基因与性能或免疫表型的关联，PLEKHH2基因与免疫能力是否有关系或有什么关系并不清楚。因此本专利技术以PLEKHH2基因作为候选基因，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，探讨其不同基因型与绵羊免疫相关性状的关联性，以期为提高绵羊的抗病性提供一个新的分子标记。

技术实现思路

[0005]针对现在养羊业使用大量药物和疫苗等问题，本专利技术的目的在于提供一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0007]本专利技术提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊
PLEKHH2基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的S表示C或G，由于上述序列在第368位碱基处有一个C/G突变，从而导致了绵羊PLEKHH2基因在该位点的C/G多态性。
[0008]一对用于检测上述分子标记的引物对，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]用于检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括正向引物AX、正向引物AY和反向引物C，所述正向引物AX的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物AY的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]一种检测上述分子标记的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。
[0011]一种检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的碱基S表示C或G，所述方法包括利用上述的引物对或检测试剂盒对绵羊全血基因组DNA进行检测。
[0012]具体的，所述方法包括使用如上所述的引物对或KASPar引物对，或者如上所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。
[0013]优选地，分型鉴定方法为直接测序法、探针法、基因芯片法和KASP基因分型技术。
[0014]进一步地，利用上述引物对检测与绵羊免疫性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：
[0015]S1、以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用引物对如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，
[0016]S2、对上述PCR的扩增产物进行测序和序列分析，从而确定多态性位点的基因型。
[0017]此外，本专利技术还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤：
[0018]a)以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行高通量水浴PCR扩增；
[0019]b)扩增结束后，采用KASP基因分型技术，通过BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
[0020]本专利技术还提供了与绵羊免疫性状相关的分子标记、用于检测与绵羊免疫性状相关分子标记的引物对或检测试剂盒或检测方法在绵羊辅助育种中的应用，通过利用本专利技术的引物对或试剂盒对PLEKHH2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出免疫力较好的绵羊品种。
[0021]如上所述的应用，优选在绵羊育种中的应用。其育种目的是为挑选出高免疫力的绵羊品种。
[0022]本专利技术的有益效果在于：
[0023]本专利技术提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，还提供了检测该分子标记的引物对或检测试剂盒或检测方法在绵羊免疫性状相关检测中的应用，通过利用本专利技术的引物对或试剂盒对PLEKHH2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出具有强免疫力的绵羊品种，为有高免疫力，健康型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发
明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为GG纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的免疫力，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。
附图说明
[0024]图1为对绵羊PLEKHH2基因片段扩增的凝胶电泳结果图。
[0025]图2为本专利技术中绵羊PLEKHH2基因突变位点的测序结果。
[0026]图3为本专利技术中绵羊PLEKHH2基因g.38384C&am本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的S表示C或G，该突变导致了绵羊PLEKHH2基因在该位点的C/G多态性。2.一对用于检测权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.用于检测权利要求1所述分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括正向引物AX、正向引物AY和反向引物C，所述正向引物AX的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物AY的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.包含权利要求2或3所述引物对的检测试剂盒。5.一种检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的碱基S表示C或G，所述方法包括利用权利要求2或3所述引物对对绵羊全血基因组DNA进行扩增检测；对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王维民，韩坤潮，李发弟，张小雪，林长春，张煜坤，张德印，李晓龙，赵源，赵利明，徐丹，周步博，王江荟，程江博，李文馨，
申请(专利权)人：民勤同泽农业有限公司，
类型：发明
国别省市：