乳腺癌诊断标志基因及其筛查方法技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术属于基因组学核生物医学技术领域，公开了乳腺癌诊断标志基因及其筛查方法，通过采用差异分析、Lasso回归分析、随机森林以及Cox分析等技术确定与Luminal B型乳腺癌亚型诊断相关的标志基因。基于这些标志基因，将Luminal B型乳腺癌划分成了两个新的亚型并在两个验证集上对两个新亚型进行了验证。被验证的Luminal B型乳腺癌亚型标志基因可用于临床上Luminal B型乳腺癌亚型筛查和诊断，同时可以联合其他临床检查结果完成临床诊治决策，实现不同亚型Luminal B型乳腺癌的早发现、早诊断和早治疗，从而大大改善Luminal B型乳腺癌患者的预后。型乳腺癌患者的预后。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌诊断标志基因及其筛查方法


[0001]本专利技术属于基因组学和生物医学
，尤其是涉及一种乳腺癌特征基因的标志基因及其筛选方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌作为高度分子异质性疾病，沿用的解剖学分期和组织学分类已不能满足其目前的临床诊治需求，尤其缺少能够标志肿瘤生物学行为并对临床治疗提供指导作用的乳腺癌组织学分类方法。因此，探求乳腺癌的致病机制，开发精准的乳腺癌筛查和治疗方法，仍然是保护女性健康的重要课题。
[0003]近年来，高通量的癌症基因组学证实，乳腺癌并非单一疾病，而是由多种亚型组成的疾病，目前通过基因表达谱对乳腺癌几个亚型(PAM50，专利号WO2009158143 A1)：即管腔上皮(表达正常乳腺管腔上皮激素受体、细胞角蛋白和相关基因)A型(Luminal A)、管腔上皮B型(Luminal B，较A型激素受体水平低，组织学级别高)、HER
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2过表达型和基底样型(basal
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like，表达乳腺上皮基底样或干细胞相关基因)，以及类正常细胞型。这几种类型在之后大量的临床研究中，证实了它们在预后和治疗反应等方面具有特异性。比如，管腔A型，侵袭性与转移性比较弱，术后复发转移风险相对低，对内分泌治疗比较敏感；管腔B型预后中等，需要内分泌治疗联合化疗；HER2阳性型和基底细胞型则预后很差；HER2阳性型，一般用抗HER2靶向治疗(曲妥珠单抗)联合化疗和(或)内分泌治疗；基底细胞型预后最差，需要化疗治疗。另外一种技术(Oncotype Dx)是对专门针对雌激素受体阳性及淋巴结阴性的乳腺癌病人，用21个基因表达量来计算复发分数，复发分数低的病人只需要内分泌治疗，复发分数高的病人则需要化疗。然而，以上两种基因分型技术均存在一些问题。PAM50分子分型不够精准，比如是否存在类正常细胞型还存在争论，各亚型之间的比例也不确定；另外，PAM50无法精确地证实哪种亚型需要用具体的化疗药物；Oncotype Dx只是针对雌激素受体阳性的乳腺癌病人，而不适用于雌激素受体阴性的病人。在专利108949983A中提供一组乳腺癌分型基因群，可将乳腺癌分为间质型、增殖型和代谢型三种亚型，不同亚型的乳腺癌具有不同的基因表达谱。不同亚型的乳腺癌病人对内分泌治疗药物和化疗药物有不同的反应，据此采用合适的药物将极大的提高乳腺癌病人的生存率。
[0004]虽然乳腺癌的发病率在上升，但乳腺癌的死亡率却在下降。这不仅仅因为靶向药物治疗的研究不断深入，乳腺癌预后得以改善，复发率降低，也是基于多种乳腺癌分子标志物的不但深入研究在早期乳腺癌诊断及预后中的应用。在专利CN104805197A中公开一种乳腺癌分子标志物S100A8/A9用于乳腺癌诊断和预后评估的方法，明确了分子标志物S100A8/A9在不同分子病理亚型的乳腺癌患者中表达存在差异，其中在基底细胞型(basal
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like)和Her
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2过表达型(Her
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2amplified)中高表达，而在管腔上皮A型(Luminal A)和管腔上皮B型(Luminal B)亚型中表达量较低，有显著统计学差异。在专利CN111424090A中涉及SGCE基因作为三阴性乳腺的标志物的应用，结果证实SGCE在三阴性乳腺癌组织或细胞中高表达，且生存分析表明SGCE基因的表达与三阴性乳腺癌的预后密切相关，说明SGCE基因可作为三阴
性乳腺癌诊断或预后评估的标志物。
[0005]近年来，研究发现在乳腺癌的所有分型中，Luminal B型所占比例较高，约占40％，该类型乳腺癌临床病理特征复杂，具有肿块较大、淋巴结转移率高、组织学分化低、内分泌治疗不敏感等特点，其预后较Luminal A型差。由于Luminal B型乳腺癌本身的异质性，导致患者预后存在较大差异，部分患者的预后甚至与HER
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2阳性以及三阴型相似，因此Luminal B型乳腺癌在诊断和治疗方面更复杂。2011年第12届St.Gallen专家共识强调：对于Luminal B型中Ki
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67高表达的患者可以考虑内分泌治疗联合化疗，是否联合化疗及化疗方案选择取决于激素受体表达水平、高危因素及患者一般状况。对于Luminal B型中HER
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2阳性患者强烈推荐全身化疗、内分泌治疗及曲妥珠单抗的靶向治疗。Luminal B型乳腺癌HER
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2高表达、Ki
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67高表达、内分泌治疗不敏感等均是造成其生存率及预后较Luminal A型乳腺癌偏低的原因。Blows等的协作组分析了12个研究共10159名乳腺癌患者在诊断前5年里Luminal B型预后较差。综上所述，Luminal B型乳腺癌临床特征复杂，治疗效果不佳，迫切需要使用生物标志物来细化Luminal B型乳腺癌的分子分型进而找到新的治疗方案，实现该类型乳腺癌的精准治疗，从而改善其预后及提高疗效预测。
[0006]有创的肿瘤基因表达谱(Gene Expression Profiling,GEP)检测从生物信息学角度提供了一种寻找肿瘤相关基因及其表达特征的手段。GEP数据中记录了组织细胞中所有可测基因的表达水平，但实际上只有少数基因才真正同样本类别相关，它们包含了样本分类的信息。因此筛选出关键基因是肿瘤GEP分析的核心内容。而如何在高维的GEP数据中有效筛选出关键的基因，一直是肿瘤GEP分析中的难点所在。因此本专利技术基于乳腺癌GEP数据，利用多种数据分析方法提出了一种Luminal B型乳腺癌的诊断标志基因筛查方法和Luminal B型乳腺癌诊断标志基因。

技术实现思路

[0007]为填补临床上缺少Luminal B型乳腺癌亚型筛查和诊断方法的空白，同时提高不同Luminal B型亚型乳腺癌的预后评估，本专利技术提供了一种Luminal B型乳腺癌亚型诊断标志基因筛查方法和乳腺癌诊断标志基因。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种Luminal B型乳腺癌亚型诊断标志基因筛查方法，所述方法操作步骤如下：
[0009]S01从TCGA数据库等获得乳腺癌mRNA、miRNA和lncRNA的HTSeq数据；
[0010]S02将样本在乳腺癌基因上的表达数据预处理；其中利用sva包检验并移除测序数据中的批次效应的影响和对基因表达数据进行缺失值和异常值检测和处理。
[0011]S02识别乳腺癌癌症样本和正常基因的差异：采用DESeq2包对乳腺癌样本和正常样本的基因表达矩阵进行差异分析，得到差异基因；
[0012]S03对得到的差异基因进行PCA分析，产生两个亚型ClusterA和ClusterB；
[0013]S04通过样本的表达数据确定了这两个亚型之间的差异基因，依据Luminal B型乳腺癌样本两个亚型之间基因表达的差异条件筛选出Luminal B型乳腺癌样本。
[0014]S05利用机器学习算法对Luminal B型乳腺癌进行分型。利用主成分分析(principal co本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Luminal B型乳腺癌亚型诊断标志基因筛查方法，所述方法操作步骤如下：S01从TCGA数据库等获得乳腺癌mRNA、miRNA和lncRNA的HTSeq数据；S02将样本在乳腺癌基因上的表达数据预处理；其中利用sva包检验并移除测序数据中的批次效应的影响和对基因表达数据进行缺失值和异常值检测和处理。S02识别乳腺癌癌症样本和正常基因的差异：采用DESeq2包对乳腺癌样本和正常样本的基因表达矩阵进行差异分析，得到差异基因；S03对得到的差异基因进行PCA分析，产生两个亚型ClusterA和ClusterB；S04通过样本的表达数据确定了这两个亚型之间的差异基因，依据Luminal B型乳腺癌样本两个亚型之间基因表达的差异条件筛选出Luminal B型乳腺癌样本。S05利用机器学习算法对Luminal B型乳腺癌进行分型。利用主成分分析(principal components analysis，PCA)获得Luminal B型乳腺癌的最佳聚类簇数；再利用ConsensusClusterPlus函数Luminal B型乳腺癌样本的基因表达矩阵进行了聚类分析，根据聚类k＝2,3,4,5时的矩阵热图、一致性累积分布函数图以及Delta Area Plot图进一步确定聚类簇数。S06筛选出Luminal B型乳腺癌新亚型的标志基因：利用DESeq2对Luminal B型乳腺癌各个新亚型的基因表达矩阵进行差异分析筛选新亚型之间的具有显著差异的基因；S07通过Lasso回归分析、随机森林以及Cox分析算法进一步筛选出Luminal B型乳腺癌新亚型之间的差异基因，所述特征基因包括以下基因及2种或2种以上的组合：FCGR3A、MMP1、SERPING1、EGFL6、SLC2A12、CORIN、EMX2、ACKR4、COL3A1、COL5A2、FN1、FNDC1、VGLL3、CFH、NT5E、RASGRF2、LRP1、CACNA2D2、CCDC24、RAB3A。2.如权利要求1所述一种Luminal B型乳腺癌亚型诊断标志基因筛查方法，其特征在于，所述乳腺癌癌症样本和正常基因的差异，其差异基因的筛选条件为padj<0.05，|log2FoldChange|>1。3.如权利要求1所述一种Luminal B型乳腺癌亚型诊断标志基因筛查方法，其特征在，所述Luminal B型乳腺癌样本两个亚型之间基因筛选的差异条件包括：ER阳性，PR阴性或低表达、HER2阴性，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵双涛，刘志东，王慧娜，于江泳，徐蔚然，
申请(专利权)人：北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：