本发明专利技术涉及植物基因技术领域，特别涉及芋内参基因Ce049358的筛选及其应用，本发明专利技术是在高表达区(FPKM)进行候选基因的分析，与同日申请的Ce047468基因相比，表达量更高、更稳定，经分析，本申请获得的芋内参基因Ce049358，能很好反映CeAGPL1在不同组织的的表达特性，可做为表达芋不同组织的内参基因，设计的特异引物还可为后续芋基因表达分析提供参考依据。还可为后续芋基因表达分析提供参考依据。还可为后续芋基因表达分析提供参考依据。
【技术实现步骤摘要】
芋内参基因Ce049358的筛选及其应用
[0001]本专利技术涉及植物基因
，特别涉及芋内参基因Ce049358的筛选及其应用。
技术介绍
[0002]芋(Colocasia esculenta)是目前重要的粮食作物之一，其块茎具有很好的食用价值，同时，芋也是广西主要的农产品之一，但是目前关于芋的分子生物学方面的研究很少，对于其基因研究目前行内报道的较少，近年来，随着高通量测序和分子生物学研究的不断发展，基因的表达分析也逐渐应用于揭示芋基因表达和调控机理的研究。随着芋基因组的测序，更加加快了芋相关性状的遗传机理解析。
[0003]实时荧光定量PCR(quantitative Real
‑
time PCR,qRT
‑
PCR)是目前检测基因表达水平的主要分析手段。目前，植物中常用来作为内参基因的基因有肌动蛋白(actin)、微管蛋白基因(β
‑
tubulin,TUB)、转录延伸因子基因(elongation factor,EF1A和EF1B)、真核起始因子(eukaryotic initiation factor,eIF)、泛素结合酶基因(ubiquitin
‑
conjugating enzyme,UBC)、组蛋白(Histone,H3
‑
1)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase,GAPDH)等。r/>[0004]但，在实际的检测中，我们发现这些内参基因在一定的实验条件下表达量并不稳定，不能很好的对芋的不同组织进行表达，因此，我们需要针对样本的不同组织或者不同生长发育时间段进行取材来筛选出稳定表达的内参基因。
技术实现思路
[0005]鉴于上述内容，有必要提供可以对芋不同组织样本进行荧光表达分析的内参基因，该基因可以对芋的表达分析，并且表达稳定。
[0006]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]芋内参基因Ce049358，所述内参基因Ce049358的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还包括检测所述芋内参基因Ce049358的引物对，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术还包括所述的芋内参基因Ce049358在芋不同组织进行荧光定量表达分析中的应用。
[0010]进一步的，所述芋不同组织为：芋的根、叶片、叶柄和球茎。
[0011]进一步的，所述荧光定量表达分析引物对的上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步的，所述荧光定量表达分析的PCR反应体系共20μL为：2X SYBR Green Master Mix 10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM上游引物0.4μl、cDNA模板1μl、RNase
‑
free water8.2μL；所述PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸20s总共45个循环；采集荧光信号。
[0013]本专利技术的芋内参基因Ce049358，筛选方法为：
[0014]1、在芋播种90d后，采集芋的叶片、叶柄、球茎和根，放入50ml的无菌冷冻管中，液氮速冻后放入
‑
80℃冰箱中备用，提取样本RNA；
[0015]2、反转录合成相应的芋组织cDNA；
[0016]3、根据不同基因设计不同引物并在荧光定量PCR仪上进行反应，绘制溶解曲线，进行稳定性分析，获得稳定性好、表达效果好的内参基因。
[0017]本专利技术具有如下有益效果：
[0018]本专利技术是在高表达区(FPKM)进行候选基因的分析，与同日申请的Ce047468基因相比，表达量更高、更稳定，内参基因的筛选是针对芋不同组织(叶片、叶柄、球茎和根)进行转录本测序的数据，以表达量FPKM值的稳定性，使用变异系数CV进行评估，选择CV值≦0.2且cDNA≧1000bp的基因作为候选内参基因。利用qRT
‑
PCR分析5个候选基因在芋不同组织表达稳定性，利用三种内参基因稳定性分析软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分析这5个候选内参基因在不同组织的稳定性并进行综合分析排序，获得芋内参基因Ce049358，经过验证，Ce049358能很好反映CeAGPL1在不同组织的的表达特性，筛选得到的内参基因及设计的特异引物为后续芋基因表达分析提供了参考依据。
【附图说明】
[0019]图1
‑
5分别为候选内参基因：Ce007097、Ce012507、Ce026647、Ce041066和Ce049358在不同组织的qPCR检测结果图；其中，M为Marker DL2000；泳道1
‑
8分别为叶
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1、叶
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2、叶柄
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1、叶柄
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2、根
‑
1、根
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2、球茎
‑
1、球茎
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2的2个平行样。
[0020]图6
‑
10分别为候选内参基因：Ce007097、Ce012507、Ce026647、Ce041066和Ce049358的扩增曲线图；
[0021]图11
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15分别为候选内参基因：Ce007097、Ce012507、Ce026647、Ce041066和Ce049358的的溶解曲线图；
[0022]图16为五个候选内参基因在不同组织的的Ct值箱线图；
[0023]图17为geNorm软件对候选内参基因的表达稳定排序；
[0024]图18为geNorm软件分析内参基因变异系数柱状图；
[0025]图19为Ce049358基因在芋不同组织的表达情况图。
【具体实施方式】
[0026]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。
[0027]实施例1：
[0028]本实施例为内参基因Ce049358的获得，其通过如下方法得到：
[0029]一、本实施例的试验材料：
[0030]本实施例的芋材料为广西农业科学院生物技术研究所选育的芋新品种桂芋2号。于播种90d后采集叶片、叶柄、球茎和根，放入50ml的无菌冷冻管中，液氮速冻后放入
‑
80℃
冰箱中备用。每组样本本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.芋内参基因Ce049358，其特征在于，所述内参基因Ce049358的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.检测如权利要求1所述芋内参基因Ce049358的引物对，其特征在于，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。3.如权利要求1所述的芋内参...
【专利技术属性】
技术研发人员：董伟清，何芳练，蒋慧萍，刘莉莉，邱祖杨，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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