用于HLA分型的方法、组合物和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一组寡核苷酸和包含一组寡核苷酸的试剂盒，其中所述寡核苷酸用于测定DNA样品的HLA基因型。本发明专利技术还涉及一种测定DNA样品的HLA基因型的方法。该方法可以用于识别移植的合适供体和/或受体，以进行亲子测试；用于识别HLA类型，以测定新抗原预测中的表位结合能力，或以诊断免疫疾病如强直性脊柱炎。该方法优选使用长程PCR和长读测序，优选使用R10型纳米孔。纳米孔。纳米孔。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HLA分型的方法、组合物和试剂盒


[0001]本专利技术涉及用于实施高分辨率HLA分型(typing)和定相(phasing)的方法、组合物和试剂盒。

技术介绍

[0002]现代器官移植技术(1)只有通过开发有效的免疫抑制剂(2)和将人类白细胞抗原/主要组织相容性复合物(3)鉴定为将移植器官识别为“外来物”的决定因素才会成为可能。
[0003]移植排异是实体器官移植中的一项重大挑战，而移植抗宿主病(GVHD)是异体组织移植如干细胞或骨髓移植后的常见并发症。移植排异可能是由T细胞和B细胞介导，并能够导致器官功能或衰竭的严重并发症。
[0004]在移植程序之前和期间保持器官活力是第二个重大挑战。器官的摘取、储存和移植可能会深刻影响器官的内部结构和功能，并能够显著影响移植完成后延迟或阻止正常器官功能恢复的程度。人体实体器官可以被有效保存的时间会因器官而异，肾脏为24
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36小时，胰腺为12
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18小时，肝脏为8
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12小时，而心脏和肺为4
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6小时。
[0005]移植的合适性通过“分型”其人白细胞抗原(HLA)等位基因而取决于合适供体和受体的匹配。HLA系统据发现位于6号染色体的短臂上，是人类基因组中多态性最强的区域之一，会编码主要组织相容性复合体(MHC)蛋白，并负责调节适应性免疫系统。
[0006]人体内所有成核细胞均表达I类HLA基因(HLA
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A、
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B、
‑/>C)，而免疫细胞则表达一些II类HLA基因(如HLA
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DRB1、
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DQB1等)。这些蛋白质表达于细胞表面并负责抗原呈递和免疫记忆机制。
[0007]HLA基因是共显性的，两条染色体上的两个等位基因都被表达，并且在参与抗原识别的外显子中具有异常多态性。
[0008]迄今为止，已在世界人群中鉴定出超过15,000个HLA I类和II类等位基因，在整个HLA区域观察到相当大的差异。单个HLA分子能够展示一系列免疫原性表位(被T细胞和抗体以不同方式识别)，而每个表位由特异性的短系列DNA碱基序列决定，而正是这些特异性序列的连接组合定义了每个HLA等位基因。
[0009]HLA蛋白在结构上进而变化的区域是与病原体片段(抗原呈递)以及与T细胞、B细胞和自然杀伤细胞上的免疫受体相互作用的那些。这也赋予HLA分子各个体之间的高度免疫原性，导致例如移植环境中的排异。
[0010]每个HLA基因还包含一系列线性内含子和多达八个外显子。对于I类HLA，多态性区域主要位于外显子二和三内，对于II类HLA，多态性区域主要位于外显子二内，但不限于此。基因其他部分的变异也与表达变异(低或高)或无效等位基因(无蛋白质产物)有关，而这包括3'非翻译区。低表达HLA变异与HLA不匹配的骨髓移植和HLA抗体不相容的器官移植的更好结果相关。因此，确定结构变体和表达变体两者的序列具有临床意义。
[0011]HLA区域的命名必然是复杂的，以允许实验室之间的标准化报告系统(5)。该命名法被称为WHO HLA系统因素命名法委员会，它以基因座名称(即HLA
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A)开头，随后接多达四
个字段(field，区域)，指示DNA序列和所得蛋白质的不同变异水平。第一个字段定义了一组与血清学定义的HLA特异性相对应的等位基因。第二个字段等同于导致蛋白质序列变化的非同义碱基对变化，而第三个字段展示不导致蛋白质变化的同义碱基对变化。第四个字段表示非编码(即内含子)区域的变化。
[0012]在器官移植过程期间，进行HLA分型以确定是否适合移植。HLA遗传学系统使用基于所观察的等位基因变异的国际分类标准，以及构成6号染色体内连续HLA区域的基因的通用表示系统(HLA
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A、B、C、DQA1、DPB1、DRB1/3/4/5等)。
[0013]肾、胰腺、心脏和肝移植至少要依赖于两个字段匹配(6)，而异基因干细胞移植的理想情况是四个字段匹配(7)，而目前用于此的主要技术是Sanger测序，即提供第二字段分辨率(8)，和用于第一字段分辨率的序列特异性PCR(SS
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PCR)(9)，这种技术使用引物组跨越HLA区域中的特异性基因座。虽然相对较快(2小时)，但该技术受限于第一个或第二个字段的较差分辨率，并且需要使用专用的实时PCR仪器。
[0014]目前用于临床HLA测试的基于DNA的方法涉及通过组合多个重叠的短序列和统计可能性而重建可能的起始序列，以确定单独序列的定相(phasing)。这些序列读数的每一个通常都比每个外显子短。连接所有多态性区域并因此定义等位基因依赖于高度复杂的化学和程序，并且由于同源区域和相关但不相同的等位基因之间的共享多态性而受到定相误差的影响。因此，短读会妨碍对HLA区域的单倍型和定相的有效分析，导致对部分HLA区域的准确分类出现问题，包括连续性纯合片段(runs of homozygosity)的区域(11)。围绕这些区域使用短读技术的引物设计具有挑战性，因为变异会使得很难设计跨越非常短区域以外的任何区域的引物，靶向特异性等位基因。HLA区域的多态性连同这些基因座的高度同源性一起使得经典NGS(下一代测序)流程不切实际：它不是单个SNP或插入缺失(indel)，而是识别必须通过基于NGS的HLA分型进行阐明的等位基因的整个外显子或整个基因序列。此外，使用该技术仍然成本高昂，测序仪器需要大量资本支出以及使用专有软件。与SS
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PCR相比，短读技术相对较慢，因为库制备和NGS步骤需要花费超过24小时，这意味着准确的四字段死者供体分型几乎是不可能的。
[0015]此外，由于基于序列的分型(SBT)主要关注前面提到的重要外显子，因此从全基因组组装中已知的定相问题可能是歧义的主要来源。在定相期间，所述各碱基差异被明确分配给染色体之一。这种在HLA分型中普遍存在的顺/反相问题在使用短读技术时不容易解决；计算相位受到测序伪影、缺失参考以及下文详述的其他因素的阻碍。这些因素能够引入不同于相位模糊的新的分型问题。相位分辨率很少能通过使用大量短读解决。短读技术的其他问题是无法找到具有未知内含子部分的新序列或已知等位基因；大多数新事物都在内含子/UTR中，如上所述，这些区域的研究不如外显子那么彻底。
[0016]因此，非常需要开发新的基于NGS的HLA分型策略，以破译受试者的整个HLA基因座，它比当前的短读技术更准确、更快、更具成本效益，并且它能够常规用于临床实验室。一个困难是要设计合适的引物以便能够准确跨HLA区域执行这样的长读。

技术实现思路

[0017]因此，在一个方面中，提供了一组寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1
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11、16
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35和37
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42的寡核苷酸或其变体。在一个实施方式中，该组寡核苷酸可以还包含SEQ ID NO：12、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种寡核苷酸组，包括SEQ ID NO：1
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11、16
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35和37
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42的寡核苷酸或其变体。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，还包括SEQ ID NO：12、13、14、15和36的寡核苷酸或其变体中的一种或多种。3.一种包含根据权利要求1或2所述的寡核苷酸组的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，还包括说明书组、DNA扩增混合物、无核酸酶水、条形码混合物、连接混合物、末端修复混合物、加尾混合物、净化混合物、适配子混合物和洗脱缓冲液中的一种或多种。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中DNA扩增混合物包含DNA聚合酶和dNTP。6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述DNA聚合酶是Taq聚合酶。7.根据权利要求4
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6中任一项所述的试剂盒，包含具有3'至5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶。8.根据权利要求2所述的寡核苷酸组，或根据权利要求3
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7中任一项所述的试剂盒，其中将SEQ ID NO：1
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11、16
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35和37
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42的寡核苷酸或其变体与SEQ ID NO：12、13、14、15和36的寡核苷酸或其变体中的一种或多种分开提供，或者其中将SEQ ID NO：1
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11、16
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35和37
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42的寡核苷酸或其变体与SEQ ID NO：12、13、14、15和36的寡核苷酸或其变体中的一种或多种一起提供。9.根据权利要求1、2或8所述的寡核苷酸组或根据权利要求3
‑
8中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸以冻干形式或在合适的缓冲液中提供。10.根据权利要求1、2、8或9所述的寡核苷酸组，或根据权利要求3
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9中任一项所述的试剂盒，用于在测定DNA样品的HLA基因型中应用。11.一种测定DNA样品的HLA基因型的方法，包括a)使根据权利要求1
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2或8
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10中任一项所述的寡核苷酸或其变体与DNA样品和DNA扩增混合物接触，所述DNA扩增混合物可选地包含DNA聚合酶，如Taq聚合酶、具有3'至5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶和dNTP中的一种或多种；和b)使用引物依赖性DNA扩增方法如PCR扩增所述DNA样品中的靶序列，从而产生扩增子；和c)测定所述扩增子的序列。12.根据权利要求12所述的方法，其中对于SEQ ID NO：1
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11、16
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35和37
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42的寡核苷酸或其变体，以及对于SEQ ID NO：12、13、14、15和36的寡核苷酸或其变体中的一种或多种独立地实施步骤a)和步骤b)。13.根据权利要求12所述的方法，其中将扩增产物结合以用于步骤c)。14.根据权利要求11
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13中任一项所述的方法，其中提供SEQ ID NO：1

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯，
申请(专利权)人：伯明翰大学医院NHS信托基金会，
类型：发明
国别省市：