苦荞天冬氨酸蛋白酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，所述的氨基酸序列具有抗立枯丝核菌的效果，其编码序列通过构建转基因植株，能够提高植株的立枯病抗性，特别是针对苦荞植株的立枯病抗性。本发明专利技术的方法简单，效果可靠、成本低廉，生产过程高效、绿色、安全、无环境污染，对农业发展具有一定推动作用。对农业发展具有一定推动作用。对农业发展具有一定推动作用。

【技术实现步骤摘要】
苦荞天冬氨酸蛋白酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种天冬氨酸肽酶基因FtASP及其编码蛋白，及其在抗立枯丝核菌中的应用。

技术介绍

[0002]苦荞(Fagopyrum tataricum)为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)的双子叶植物，富含蛋白质、维生素及各种药用类黄酮物质。近年来随着种植面积的不断增加，立枯病也呈逐年加重的趋势，现已成为荞麦第一大病害。
[0003]荞麦立枯病病原体是一种多核的立枯丝核菌，具3个或3个以上的细胞核，菌丝较大。在土壤中能形成薄层蜡质状或白粉色网状至网膜状子实层，产生的担子桶形至亚圆筒形，担子具3
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5个小梗，其上着生担孢子；担孢子椭圆形至宽棒状，担孢子能重复萌发，在担子上形成2次担子。该菌由单一菌丝尖端的分枝密集而形成或是由尖端紧密地和菌丝密集而形成菌丝结。由致病菌菌侵染引起的荞麦立枯病主要在幼苗期危害地下种子或幼苗茎基部，严重时可导致种子腐烂，幼苗萎蔫枯死，导致产量和品质显著下降，荞麦立枯病抗性问题亟待解决。
[0004]天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)是一类蛋白水解酶，其可以在酸性pH下以天冬氨酸残基作为催化活性位点，在植物生长发育和防御反应过程中起着重要作用。植物天冬氨酸蛋白酶均含有保守结构，即天冬氨酸
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苏氨酸
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甘氨酸(DTG)和天冬氨酸
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丝氨酸
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甘氨酸(DSG)保守活性中心，其次还有N端的信号肽、前导片段、PSI和C端结构。天冬氨酸蛋白酶已被证明在胡萝卜、番茄和小麦中能够抑制病原菌分泌的糖基水解酶和木聚糖酶等。然而荞麦中天冬氨酸生物代谢过程及其主要功能研究领域几乎仍是空白。在本研究中通过基因克隆和筛选获得了一个重要的FtASP基因，其对立枯病的抗性功能进行了较系统的探究，填补了苦荞中天冬氨酸蛋白酶功能研究的空白。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于苦荞天冬氨酸蛋白酶研究的核苷酸序列和氨基酸序列，旨在提高植株的立枯病抗性，为农业生产提供新的方法。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种氨基酸序列。
[0007]所述的氨基酸序列为包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0008]所述的氨基酸序列所表示的蛋白的分子量约24.1KDa，所编码蛋白的等电点(pI)为9.10，为疏水蛋白。预测该蛋白的三级结构如图4。
[0009]另一方面，本专利技术提供了编码前述的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0010]所述的核苷酸序列可以用于表达前述的氨基酸序列，包括基于密码子简并性具有表达前述氨基酸序列功能的任意核苷酸序列。
[0011]作为优选地，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，或与SEQ ID NO.2具有93.5％以上相似性的核苷酸序列。
[0012]本专利技术同时提供了前述的核苷酸序列的表达载体以及包含该表达载体的基因工程细胞。
[0013]所述的表达载体上还可以包括编码His标签的序列；所述的His标签上包括4
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10个His，优选为6个。
[0014]再一方面，本专利技术提供了前述的氨基酸序列(蛋白)的制备方法。
[0015]所述的制备方法通过基因工程表达前述的核苷酸序列实现。
[0016]具体地，所述的制备方法中包括：将前述的核苷酸序列插入表达载体，转染细胞后培养细胞进行表达。
[0017]优选地，所述的制备方法中包括将前述的核苷酸序列插入His标签载体后获得His
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FtASP重组质粒进行表达。
[0018]优选地，所述的细胞包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
[0019]所述的制备方法中还可以包括对前述的核苷酸进行扩增。所述的扩增可以是PCR扩增。所述的PCR扩增的引物可以选自SEQ ID NO.3
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6。
[0020]再一方面，本专利技术提供了前述的氨基酸序列或核苷酸序列或表达载体或基因工程细胞在抑制立枯丝核菌中的应用。
[0021]本专利技术同时提供了包含前述的氨基酸序列或表达载体或基因工程细胞的抑制立枯丝核菌的制剂，具体为抗菌剂。
[0022]又一方面，本专利技术提供了前述的核苷酸序列或表达载体或基因工程细胞在构建抗立枯病的植株中的应用。
[0023]具体地，所述的立枯病的病原体为立枯丝核菌。
[0024]又一方面，本专利技术提供了一种过表达FtASP基因的植株的构建方法。
[0025]所述的方法中包括使用前述的核苷酸序列插入载体构建重组载体，重组载体转染菌株获得重组菌，重组菌株侵染目标植株获得过表达FtASP基因的植株。
[0026]优选地，所述的重组载体为过表达载体pCAMBIA 1307
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FtASP。
[0027]所述的过表达载体pCAMBIA 1307
‑
FtASP上包括FtASP的全长序列。
[0028]所述的全长序列的扩增引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
[0029]所述的全长序列的扩增模板为FtASP
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T载体。
[0030]所述的FtASP
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T载体的制备方法为：引物扩增来源于苦荞的cDNA模板。
[0031]所述的引物可以是SEQ ID NO.3
‑
4。
[0032]所述的苦荞的品种可以是苦荞1号。
[0033]优选地，所述的转染菌株为转染农杆菌。
[0034]优选地，所述的农杆菌采用蘸花法侵染目标植株。
[0035]优选地，所述的植株为拟南芥或苦荞。
[0036]本专利技术的有益效果：
[0037]通过基因克隆获得了一个重要的FtASP基因，利用基因工程手段，将天冬氨酸蛋白酶FtASP基因进行遗传转化获得过表达的转基因拟南芥，并进行抗立枯丝核菌鉴定发现FtASP转基因拟南芥具有更高的病菌抗性；创建了His
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FtASP、His
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FtASP
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N及His
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FtASP
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C融合载体，将其转化至宿主菌进行原核表达以快速获得重组His
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FtASP、His
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FtASP
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N及His
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FtASP
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C蛋白，并完成了重组蛋白对立枯丝核菌生长的影响鉴定；同时，为后续深入研
究天冬氨酸的代谢机制奠定了理论基础。本专利技术效果可靠、成本低廉；生产过程高效、绿色、安全、无环境污染。
附图说明
[0038]图1为pCAMBIA 1307载体图谱。
[0039]图2为PET28A载体图谱。
[0040]图3为转基因植株FtASP基因表达量。
[0041]图4为F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示的序列。2.编码权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，为SEQ ID NO.2，或与SEQ ID NO.2具有93.5％以上相似性的核苷酸序列。4.包含权利要求2
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3任一项所述的核苷酸序列的表达载体。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，还包括编码组氨酸标签的序列。6.包含权利要求4
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5任一项所述的表达载体的基因工程细胞。7.权利要求1所述的氨基酸序列的制备方法，其特征在于，通过基因工程表达权利要求2
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3任一项所述的核苷酸序列进行制备。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括将权利要求2
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3任一项所述的核苷酸序列插入His标签载体后获得His
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FtASP重组质粒进行表达。9.权利要求1所述的氨基酸序列或权利要求2
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3任一项所述的核苷酸序列或权利要求4
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5任一项所述的表达载体或权利要求6所述的基因工程细胞在抑制立枯丝核菌中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周美亮，关超男，卢翔，张凯旋，何毓琦，李光胜，
申请(专利权)人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院，
类型：发明
国别省市：