一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法技术

本发明专利技术涉及一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法，包括以下步骤：加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二硫苏糖醇溶液，涡流2min；还原，60℃超声30min；衍生化，冷却后加入10.0mL 250mM碘乙酰胺溶液，避光条件下低速涡流30min；蛋白沉淀，加入冷藏后的甲醇200μL，涡流10min，14000rpm，4℃，离心10min；超声酶解，取上清后丢弃，加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液，涡流2min，加入100mL 0.500mg/mL胰蛋白酶溶液，60℃超声60min；富集浓缩，加入50.0μL含1％甲酸的乙腈溶液，涡流2min，加入200μL乙腈，涡流5min，14000rpm，4℃，离心10min，取200μL上清液到96孔板中，氮气吹干，加入100μL初始流动相复溶，涡旋混匀；仪器检测，取5μL进行LC

【技术实现步骤摘要】
一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法


[0001]本专利技术涉一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体药物具有高靶向性、高特异性、低毒性等特征，是重要的生物医药研发品种。贝伐珠单抗是全球畅销药物之一，临床用于治疗各种转移性癌症。药物研发过程中或临床药物监测时，需要测定生物基质中贝伐珠单抗的浓度。目前检测贝伐珠单抗的技术主要为酶联免疫法、液相色谱
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串联质谱法。酶联免疫法灵敏度高，但其使用的试剂盒成本较高，且重现性较差。液相色谱
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串联质谱法应用于贝伐珠检测时，灵敏度通常比较低。如须提高灵敏度，通常需要采用抗体亲和富集的方法，成本较高。另外，目前报道的质谱定量检测贝伐珠单抗的技术通常需要较长时间的酶解反应，因此大大降低了检测的通量。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法，包括以下步骤：
[0006]加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二硫苏糖醇溶液，涡流2min；
[0007]还原变构，60℃超声30min；
[0008]衍生化，冷却后加入10.0mL 250mM碘乙酰胺溶液，避光条件下低速涡流30min；
[0009]蛋白沉淀，加入冷藏后的甲醇200μL，涡流10min，14000rpm，4℃，离心10min；
[0010]超声酶解，取上清后丢弃，加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液，涡流2min，加入100mL 0.500mg/mL胰蛋白酶溶液，60℃超声60min；
[0011]富集浓缩，加入50.0μL含1％甲酸的乙腈溶液，涡流2min，加入200μL乙腈，涡流5min，14000rpm，4℃，离心10min，取200μL上清液到96孔板中，氮气吹干，加入100μL初始流动相复溶，涡旋混匀；
[0012]仪器检测，取5μL进行LC
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MS/MS分析，其中，
[0013]仪器检测中的色谱条件，采用Eclipse Plus C18色谱柱，梯度洗脱，流速200μL/min，柱温50℃，进样量5μL，流动相A为0.5mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动B中含有0.1％甲酸；
[0014]仪器检测中的质谱条件，电喷雾电离源，电压为5500V；离子源温度为550℃；Gas 1、Gas 2、Curtain Gas压力分别为60、80和25psi，扫描模式为+MRM，监测离子反应分别为：贝伐珠单抗特征肽段FTFSLDTSK m/z 523.2
→
m/z 797.4，CE为23eV；DP为100V，扫描时间为300ms。
[0015]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0016]1、本专利技术血液用量少检测灵敏度高，仅使用20μL血液即可达到500ng/mL的定量限，适合血液体积较少的药物临床前研究或癌症患者的临床药物监测。
[0017]2、本专利技术仅使用蛋白沉淀法进行药物的富集，相对于免疫亲和吸附法成本大大降低，且操作步骤简便。
[0018]3、本专利技术使用超声酶解技术，相对于原有的酶解技术的12小时左右的酶解时间，本专利技术酶解时间为1小时，效率提高了10倍以上，大大提高了检测速度和通量。
[0019]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0021]图1是本专利技术的检测流程图；
[0022]图2是本专利技术的空白食蟹猴血清的MRM色谱图；
[0023]图3是本专利技术的LLOQ的MRM色谱图；
[0024]图4是本专利技术的贝伐珠单抗特征肽段FTFSLDTSK产物离子质谱图；
[0025]图5是本专利技术贝伐珠单抗的标准曲线图；
具体实施方式
[0026]结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0027]实施例
[0028]缩写说明
[0029][0030]1材料
[0031]1.1仪器
[0032]色谱仪：LC
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20AD液相色谱系统，日本岛津公司。
[0033]质谱仪：5500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(Turbo Ion Spray)加拿大Sciex公司。
[0034]数据处理采用软件：Analyst(version 1.6.3)，加拿大Sciex公司。
[0035]离心机：5810R型离心机，艾本德公司。
[0036]分析天平：AB265
‑
S型分析天平，梅特勒公司。
[0037]1.2标准品和试剂
[0038]贝伐珠标准溶液(25.0mg/mL)；甲醇采购于Sigma公司；碘乙酰胺采购于Aladdin公司；二硫苏糖醇采购于Aladdin公司；乙腈采购于美国ThermoFisher公司；醋酸铵采购于美国ROE公司；胰蛋白酶采购于上海泰坦科技股份有限公司。碳酸氢铵采购于上海凌峰化学试剂有限公司；甲酸采购于日本TLC公司；蒸馏水购于Watsons。
[0039]2方法
[0040]2.1溶液的配制
[0041]标准曲线和质控样品
[0042]吸取贝伐珠标准溶液，以食蟹猴空白血清逐级稀释得到系列浓度标准曲线样品，贝伐珠浓度分别0.500、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0和12.0μg/mL。吸取贝伐珠标准溶液，以食蟹猴空白血清逐级稀释得到系列浓度质控样品，贝伐珠浓度分别0.500(LLOQ)、1.25(LQC)、5.00(MQC)和9.00μg/mL(HQC)。
[0043]2.2血清样品处理
[0044]加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定猴血清中贝伐珠单抗的浓度的质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：加样，取猴血清样品20.0μL，置于2.0mL离心管中，加60.0μL 0.1mg/mL十二烷基磺酸钠溶液，涡流2min，加入20.0μL 50.0mM二硫苏糖醇溶液，涡流2min；还原变构，60℃超声30min；衍生化，冷却后加入10.0mL 250mM碘乙酰胺溶液，避光条件下低速涡流30min；蛋白沉淀，加入冷藏后的甲醇200μL，涡流10min，14000rpm，4℃，离心10min；酶解，取上清后丢弃，加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液，涡流2min，加入100mL 0.500mg/mL胰蛋白酶溶液，60℃超声60min；富集浓缩，加入50.0μL含1％甲酸的乙腈溶液，涡流2min，加入200μL乙腈，涡流5min，14000rpm，4℃，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：左正龙，段云海，宗于健，邹小芳，程玮，狄丹丹，杨勇，
申请(专利权)人：苏州澄耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：