溶血葡萄球菌RPA-LFS检测引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了溶血葡萄球菌RPA

【技术实现步骤摘要】
溶血葡萄球菌RPA
‑
LFS检测引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术涉及溶血葡萄球菌检测领域，具体为溶血葡萄球菌RPA
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LFS检测引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]溶血葡萄球菌是一种革兰氏阳性、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)，作为共生生物寄居在人类皮肤和粘液中，已被公认为侵入性医疗器械相关感染的重要医院内病原体。该物种占临床CoNS感染的10
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20％，是临床分离的CoNS频率较高的物种之一。临床数据统计，溶血葡萄球菌感染可导致菌血症、脑膜炎、眼部感染、皮肤感染、腹膜炎、尿路感染等，并且该菌种在异物相关感染和早产新生儿感染中占很大比例。最近的研究表明，约75％的溶血葡萄球菌具有多重耐药性。其形成生物膜的能力，可产生苯酚可溶性调节蛋白，以及大量插入序列的存在导致频繁的基因组重排被认为是导致其具有多重耐药性的因素。随着越来越多高耐药性临床分离株的出现，溶血葡萄球菌感染的预防和治疗变得越发困难，已成为全世界的医疗负担。因此，及时准确的诊断溶血葡萄球菌，对临床治疗药物的选择和治疗方案的制定起到十分重要的作用。
[0003]目前检测溶血葡萄球菌的常规方法主要为传统培养法(GB 4789.4
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2016)，该方法灵敏度高，但效率较低，操作流程复杂(包括增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴定等步骤)，通常需要4
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5天时间才可得知检测结果，无法实现现场即时检测(point
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of
‑/>care testing，POCT)。随着分子生物学技术的发展，分子检测逐渐取代传统检测。最主流的分子检测为聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)，主要包括DNA双链变性(90
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96℃)、退火(40
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65℃)、延伸(68
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75℃)等步骤。Schuenck等研究者开发了一个基于溶血葡萄球菌特异性mvaA基因序列的PCR反应体系以鉴定溶血葡萄球菌，该基因编码3
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羟基
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3甲基戊二酰辅酶A(羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶)，一种参与微生物的丙戊酸途径的蛋白质，特异性存在于溶血葡萄球菌中。该方法虽然检测精度高，时间较短，但局限于精密的仪器和专业的技术人员，在一定程度上会受到环境与设备的限制，难以打破实验室的壁垒。因此，建立一种方便、快捷的分子检测方法，对于快速诊断溶血葡萄球菌至关重要。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术(Recombinantpolymerase amplification，RPA)是由英国剑桥ASM Scientific Ltd的Piepengurg等研究者于2006年研发的一种不依赖于精密仪器、可在37
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42℃恒温、短时间内扩增目的基因的核酸扩增技术。相较于其他等温扩增技术，RPA扩增技术操作更方便，可适应较大范围的反应温度，反应体系更简单。RPA反应体系主要包括关键酶、能量供应体系(三磷酸腺苷)、稳定反应体系(Tris、醋酸钾、醋酸镁)组成。关键酶主要包括：DNA聚合酶(DNApol)、T4噬菌体uvsX重组酶和辅助因子uvsY、单链结合蛋白(SSB)。重组蛋白酶T4 uvsX在辅助因子uvsY的帮助下，与引物结合，形成DNA核蛋白微丝复合物。核蛋白微丝能迅速找到目的基因片段，引物与其同源序列紧密结合，uvsX脱落，随后在DNApol作用下对目的基因片段进行扩增反应。在此过程中，单链结合蛋白与被置换的DNA单链结合，防止单链恢复成双链。该过程不断循环可指数型扩增目的基因，直至反应体系中
能量耗尽。目前RPA扩增已成功应用于多种微生物的检测，但未见用于检测溶血葡萄球菌的报道。
[0005]侧向流动试纸条(lateral flow strips，LFS)是一种操作简便的纸基POCT装置，它由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。LFS最常用的信号标签是纳米胶体金颗粒(AuNPs)，将包被AuNPs的侧向试纸条与RPA反应联合使用，通过目测显色标记物即可直观检测结果。RPA
‑
LFS反应依赖一条特异性寡核苷酸链探针，探针中部包含一个四氢呋喃脱碱基位点(THF)，5
’
端由荧光基团FAM或FITC修饰，3
’
端由聚合酶延伸封闭基团C3
‑
spacer修饰。RPA
‑
LFS下游引物的5
’
端使用生物素(Biotin)标记。当进行RPA反应时，探针与上游靶序列结合，THF位点被大肠杆菌核酸外切酶nfo识别并切割，形成游离的3
’‑
OH，在DNA聚合酶辅助下合成5
’
端带有荧光标记且3
’
端带有生物素标记的二元复合产物。将扩增产物滴加于核酸试纸条上，产物会与位于结合垫上胶体金标记的抗荧光基团抗体结合，形成三元复合物。液体样品在毛细作用下向吸水垫流动，当三元复合物扩散到检测线时，该复合物会被抗生物素抗体捕获，检测线上积累大量纳米金颗粒，产生肉眼可见的红色条带。RPA
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LFS技术进一步简化了检测过程，实现了无需精密仪器的现场快速检测，通过肉眼即可进行定量分析，为此提供了溶血葡萄球菌RPA
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LFS检测引物探针组合及其应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供溶血葡萄球菌RPA
‑
LFS检测引物探针组合及其应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供溶血葡萄球菌RPA
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LFS检测引物探针组合，包括mvaA
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F/R/P引物探针组合；
[0008]所述mvaA
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F/R/P引物探针组合中；
[0009]mvaA
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F的序列为：CATTTTGTCTAACCATGCCACAGCCTCAGT；
[0010]mvaA
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R的序列为：Biotin
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AACAGCAGCAACGAGCGGACTTAATTCTT G；
[0011]mvaA
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P的序列为：FITC
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CATTTTGTCTAACCATGCCACAGCCTCAGT[THF]GTACGAGTTCACGGT
‑
/C3
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spacer/。
[0012]溶血葡萄球菌RPA
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LFS检测引物探针组合的应用，所述mvaA
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F/R/P引物探针组合可用于溶血葡萄球菌的RPA
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LFS的检测，为最佳的引物探针组合。
[0013]本专利技术利用RPA
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LFS技术开发了建立了一种基于重组酶聚合酶扩增和侧向流动试纸条技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.溶血葡萄球菌RPA
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LFS检测引物探针组合，其特征在于：包括mvaA
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F/R/P引物探针组合；所述mvaA
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F/R/P引物探针组合中；mvaA
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F的序列为：CATTTTGTCTAACCATGCCACAGCCTCAGT；mvaA
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R的序列为：Biotin
‑
AACAGCAGCAACGAGCGGACTTAATTCTT G；mvaA
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P的序列为：FITC
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高绪柱，季拓，高玉芝，
申请(专利权)人：连云港市第二人民医院连云港市临床肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：