基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法技术

本发明专利技术涉及基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系对有/无金黄色葡萄球菌的样品进行识别和区分。含有金黄色葡萄球菌的样品在双酶识别反应体系中产生有效燃料链，引发DNA步行器沿着运动轨道发生位移，进一步触发荧光共振能量转移，最终获得与目标浓度相关的放大荧光信号；根据荧光强度与金黄色葡萄球菌浓度之间的关系测定污染样品中金黄色葡萄球菌的浓度。本发明专利技术提高了DNA步行器的可控性和运动效率，降低脱轨和中断的风险。在9

【技术实现步骤摘要】
基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法


[0001]本专利技术涉及一种基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，属于检测


技术介绍

[0002]微生物污染是一个常见的环境问题。食用受污染食品引起的食源性疾病是对人类健康和食品安全的重要威胁之一。因此，迫切需要开发食品污染微生物检测方法。与传统的检测技术相比，生物传感器利用生物识别元件来识别目标并进行快速灵敏的检测效果，在微生物检测方面显示出巨大的潜力。在生物识别元件中，核酸适体是通过指数富集(SELEX)技术进行配体系统进化在体外筛选的一类DNA或RNA分子。它们具有易于合成、储存稳定和可定制的优点。目前，基于适配体的生物传感技术已应用于有害微生物的检测。
[0003]随着DNA纳米技术的发展，基于DNA良好的可编程性和可寻址性构建了各种静态和动态的DNA纳米结构，包括DNA四面体、DNA纳米花、DNA步行器等。其中，DNA步行器依靠连续运动来完成信号输出的起始和积累，在有效的信号放大和可控监测方面显示出巨大的潜力。DNA步行器的连续运动可以通过两种方式实现。一种是通过设计一个偏置的系统状态，使步行器自发地从较高的能量状态运动到较低的能量状态。另一种是通过消耗燃料分子，反应系统的平衡状态被添加的燃料分子打破，步行器通过运动使系统重新回到平衡状态。其中，消耗燃料分子的运动模式设计更为简便。燃料链促使DNA步行器中发生链置换反应，利用反应体系中底物链和燃料链之间氢键的热力学和动力学平衡作为驱动力。
>[0004]通常情况下DNA步行器的运动需要一定的平台，如电极、芯片、纳米颗粒等。然而，这些额外添加的物质可能会在一定程度上干扰检测系统的稳定性。已有研究表明金纳米颗粒可能对某些小分子具有吸附作用，进而对测定结果产生影响。DNA步行器的骨架轨道由底物分子按照设定的规则排列形成的，这种由DNA自组装技术构建的运动轨道可以避免此类问题。DNA自组装结构通过合理的设计能够形成稳定的结构、拥有良好的机械、电化学或光学性能，这些特性对基于DNA步行器传感器的设计具有优势。根据DNA步行器的运动方式和范围，步行轨道可分为一维线性轨道、二维轨道和三维轨道。其中，一维线性轨道制备方法简单，使用该轨道的DNA步行器具有良好的方向性和可控性。结合其他信号放大策略，可以改善效率略低的情况。
[0005]DNA步行器可以沿着各种轨迹发生循环运动，针对这种独特的运动特性寻找合适的信号输出方式，对于构建生化分析平台具有重要意义。
[0006]但是，传统DNA步行器的运动依赖于在相应的基质表面的重复运动，实现对目标物信号的放大，然而该过程具有一定的随机性，这就限制DNA步行器的可控性和运动效率，存在一定的脱轨和中断的风险。
[0007]基于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对现有技术存在的不足，提供了基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，
[0009]本专利技术的具体技术方案如下：
[0010]基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过构建核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系对含/不含金黄色葡萄球菌的样品进行区分，所述核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系包括适配体识别体系、核酸外切酶I反应体系、核酸外切酶III反应体系。
[0011]金黄色葡萄球菌适配体和cDNA1部分互补构成适配体识别体系，金黄色葡萄球菌适配体与金黄色葡萄球菌结合后释放cDNA1，游离的cDNA1单链被核酸外切酶I水解；在核酸外切酶III反应体系中，Hp与cDNA2部分互补，水解产物加入该体系后，在酶切作用下产生特定水解产物作为有效燃料链。
[0012]导航型DNA步行器(简称DNA步行器)的运动轨道有四条支撑DNA以及两条含猝灭基团的短链自组装形成，样品中的金黄色葡萄球菌经过核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系的识别和反应后产生有效燃料链，触发导航型DNA步行器沿着骨架轨道发生位移，引起荧光共振能量转移的发生，产生与目标浓度相关的放大荧光信号(增强型荧光信号)，目标浓度是指样品中的金黄色葡萄球菌的浓度。而不含金黄色葡萄球菌的空白样无法发生相应的反应，导航型DNA步行器在没有燃料链的作用下保持稳定状态，仅收集到较弱的荧光背景信号。
[0013]上述技术方案的进一步优化，具体步骤如下：
[0014]步骤S1、构建核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系
[0015]适配体识别体系：将金黄色葡萄球菌适配体和cDNA1序列加入PBS缓冲液中混匀，加热进行热变性得到第一混合物，然后对第一混合物进行孵育以制备适配体/cDNA1双链；含有金黄色葡萄球菌的溶液经过离心，使用PBS缓冲液清洗沉淀后重悬于PBS缓冲液中，得到含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液；
[0016]核酸外切酶I反应体系：将含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液与适配体/cDNA1双链混合，随后加入10
×
核酸外切酶I反应缓冲液、双蒸水和核酸外切酶I进行孵育，反应结束后得到第二混合物，对第二混合物离心，取上清液孵育使核酸外切酶I灭活，冷却至室温得到核酸外切酶I反应体系物；
[0017]核酸外切酶III反应体系：将核酸外切酶I反应体系物加入Hp和cDNA2、核酸外切酶III、10
×
核酸外切酶III反应缓冲液和双蒸水进行孵育，反应结束后灭活，得到核酸外切酶III反应体系物；
[0018]步骤S2、DNA骨架轨道制备
[0019]分别将S1、S2、S3、S4、导航型DNA步行器、Q1和Q2加入PBS缓冲液中，加热进行热变性，冷却后在不同温度梯度下进行孵育，得到DNA骨架轨道溶液；
[0020]步骤S3、荧光信号检测和标准曲线制备
[0021]取得到核酸外切酶III反应体系物与DNA骨架轨道溶液混合，孵育，使用多功能酶标仪读取激发波长488nm、发射波长605nm处的ROX荧光强度；使用PBS缓冲液将金黄色葡萄球菌连续稀释10倍来制备不同浓度的金黄色葡萄球菌样品，根据金黄色葡萄球菌浓度的对
数值与ROX荧光强度的关系，绘制相应的线性曲线，计算线性回归方程和检出限；
[0022]步骤S4、实际样品检测
[0023]将含有金黄色葡萄球菌的水样按照步骤S1～S3操作，测定相应的荧光信号，并按照线性回归方程计算水样中的金黄色葡萄球菌的浓度。
[0024]上述技术方案的进一步优化，所述金黄色葡萄球菌适配体序列为：5
’‑
GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
‑3’
，即序列表SEQ ID NO.1。
[0025]上述技术方案的进一步优化，所述cDNA1序列为：5
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：通过构建核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系对含/不含金黄色葡萄球菌的样品进行区分，所述核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系包括适配体识别体系、核酸外切酶I反应体系、核酸外切酶III反应体系；金黄色葡萄球菌适配体和cDNA1部分互补构成适配体识别体系，金黄色葡萄球菌适配体与金黄色葡萄球菌结合后释放cDNA1，游离的cDNA1单链被核酸外切酶I水解；在核酸外切酶III反应体系中，Hp与cDNA2部分互补，水解产物加入该体系后，在酶切作用下产生特定水解产物作为有效燃料链；导航型DNA步行器的运动轨道有四条支撑DNA以及两条含猝灭基团的短链自组装形成，样品中的金黄色葡萄球菌经过核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系的识别和反应后产生有效燃料链，触发导航型DNA步行器沿着骨架轨道发生位移，产生与目标浓度相关的放大荧光信号，目标浓度是指样品中的金黄色葡萄球菌的浓度；不含金黄色葡萄球菌的空白样仅收集到荧光背景信号。2.根据权利要求1所述的基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤S1、构建核酸外切酶I和核酸外切酶III的双酶识别反应体系适配体识别体系：将金黄色葡萄球菌适配体和cDNA1序列加入PBS缓冲液中混匀，加热进行热变性得到第一混合物，然后对第一混合物进行孵育以制备适配体/cDNA1双链；含有金黄色葡萄球菌的溶液经过离心，使用PBS缓冲液清洗沉淀后重悬于PBS缓冲液中，得到含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液；核酸外切酶I反应体系：将含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液与适配体/cDNA1双链混合，随后加入10
×
核酸外切酶I反应缓冲液、双蒸水和核酸外切酶I进行孵育，反应结束后得到第二混合物，对第二混合物离心，取上清液孵育使核酸外切酶I灭活，冷却至室温得到核酸外切酶I反应体系物；核酸外切酶III反应体系：将核酸外切酶I反应体系物加入Hp和cDNA2、核酸外切酶III、10
×
核酸外切酶III反应缓冲液和双蒸水进行孵育，反应结束后灭活，得到核酸外切酶III反应体系物；步骤S2、DNA骨架轨道制备分别将S1、S2、S3、S4、导航型DNA步行器、Q1和Q2加入PBS缓冲液中，加热进行热变性，冷却后在不同温度梯度下进行孵育，得到DNA骨架轨道溶液；步骤S3、荧光信号检测和标准曲线制备取得到核酸外切酶III反应体系物与DNA骨架轨道溶液混合，孵育，使用多功能酶标仪读取激发波长488nm、发射波长605nm处的ROX荧光强度；使用PBS缓冲液将金黄色葡萄球菌连续稀释10倍来制备不同浓度的金黄色葡萄球菌样品，根据金黄色葡萄球菌浓度的对数值与ROX荧光强度的关系，绘制相应的线性曲线，计算线性回归方程和检出限；步骤S4、实际样品检测将含有金黄色葡萄球菌的水样按照步骤S1～S3操作，测定相应的荧光信号，并按照线性回归方程计算水样中的金黄色葡萄球菌的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌适配体序列为：5
’‑
GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTG GTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
‑3’
，即序列表SEQ ID NO.1。4.根据权利要求2所述的基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于：所述cDNA1序列为：5
’‑
TGGTTGGTTGTTAGCAAAGTAGCGTGCACT
‑3’
，即序列表SEQ IDNO.2。5.根据权利要求2所述的基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于：所述Hp序列为：5
’‑
CGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTAGCGTGCACTTTTGACGT AGCTGTGGGATGACCAGCGAGCGCTACTGAGAACGTGCCGAGGAAGT ACC
‑3’
，即序列表SEQ ID NO.3。6.根据权利要求2所述的基于导航型DNA步行器和荧光调控机制的金黄色葡萄球菌荧光检测方法，其特征在于：所述c...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新章，蔡蓉凤，周楠迪，
申请(专利权)人：南通凯恒生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：