一种棉花编码bHLH基因GhbHLH121及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种棉花编码bHLH基因GhbHLH121及其应用，其序列在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM

【技术实现步骤摘要】
一种棉花编码bHLH基因GhbHLH121及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术应用领域，具体涉及一种棉花编码bHLH基因GhbHLH121及其应用。

技术介绍

[0002]植物的生命活动进程离不开铁元素的参与，铁元素通常直接(作为辅酶因子)或间接(氧化还原反应)参与植物多种生理生化过程，例如：光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的合成等诸多生理代谢过程的电子传递链或酶促反应。土壤中Fe
2+
和Fe
3+
的形式的存在主要取决于土壤的pH值，全世界有将近三分之一的可用耕地为盐碱地，盐碱地中的高碳酸盐含量造成土壤的相对pH值较高，在碱性环境下Fe的化学形态主要是Fe
3+
的形式，以Fe2O3或者Fe(OH)3的形式存在，这种不溶性的Fe无法被植物根系直接吸收，只有将Fe
3+
转化为Fe
2+
形式才能被植物吸收。因此碱性土壤限制了植物对铁的吸收，铁的缺乏抑制了植物的生长发育。
[0003]棉花(Gossypium spp.)，是世界上重要的一种经济作物，属于被子植物门(Angiospermae)、双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、锦葵科(Malvaceae)、棉属(Gossypium)，一般为一年生亚灌木，在热带和亚热带地区也有原始类型的多年生灌木或小乔木。棉纤维是最重要的天然纺织原料，在世界及我国国民经济中占重要地位。棉花具有深层发达的根部组织，并且能够分泌多糖、多酚等次级代谢产物，因此棉花是一种具有较高耐盐碱性地经济作物，其耐盐碱性高于普通的粮食作物。据国土资源部门统计，新疆盐碱地面积266.7万公顷，占可开垦总面积的40％。棉花主要种植区土壤pH通常在8.0以上，新开垦土地pH甚至能达到10.0。虽然棉花具有较强的耐盐碱性，但当土壤当中的碱性过高时，棉花依旧会遭到碱的毒害。具体表现为棉花出苗率降低，光合作用减弱，发育缓慢。因此，提高棉花对铁的利用率，增强棉花对缺铁的耐受性，有助于提高棉花耐盐碱性，同时提高土地利用率，为其他粮食作物和经济作物提供更多的可用耕地。
[0004]植物为了适应缺铁胁迫，进化出复杂的缺铁调控网络，该网络包含大量转录因子，其中bHLH转录因子家族在植物缺铁的调控机制中起到重要的作用。以拟南芥为例，AtFIT(AtbHLH29，bHLH IIIa)是铁信号通路中的核心元件。缺铁条件下，FIT和bHLH Ib基因(bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101)上调。四种bHLH Ib蛋白与FIT相互作用，形成异质二聚体，诱导IRT1和FRO2的转录。FIT网络里的缺铁响应基因主要都位于根表皮细胞中，但在维管束和中柱鞘内也有一系列基因响应缺铁，这部分基因主要受PYE调控。AtPYE作为负调控因子参与铁调控网络，在铁在植物体内的重新分配中发挥重要作用。在缺铁下AtPYE作为负调控因子通过直接抑制AtFRO3和AtNAS4的转录从而参与植物中铁的转运。研究表明PYE和bHLH38，bHLH39，bHLH100，bHLH101的转录均受bHLH34，bHLH104，bHLH105，bHLH115的调控。AtbHLH121最近被鉴定为拟南芥中缺铁反应的正调节因子。
[0005]棉花中有关于缺铁调控的研究鲜有报道，仅发现GhAPX通过提高铁吸收基因的表达提高棉花对缺铁的耐受性。已经证实在水稻，拟南芥，番茄等作物中，bHLH转录因子可以
参与对铁的调控。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种对棉花铁稳态具有直接调控功能的基因，并且通过基因工程对该基因的表达活性进行调整，以有效达到提高棉花缺铁耐受性的目的，实现培育耐盐碱的棉花品种。
[0007]本专利技术的目的之一在于提供一种棉花缺铁响应基因GhbHLH121，其序列在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM
‑
1A亚组中如SEQ ID NO.1所示，在四倍体陆地棉(G.hirsutum)TM
‑
1D亚组中如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术目的之二在于提供所述基因GhbHLH121的克隆方法及两种重组质粒。
[0009]本专利技术目的之三在于提供所述基因GhbHLH121的工程应用。
[0010]具体的，本专利技术提供了所述基因GhbHLH121在增强棉花和拟南芥缺铁耐受性能力中的应用。
[0011]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0012]本专利技术提供了一种扩增基因GhbHLH121的方法，所用的扩增引物对如下：
[0013]LJ1:ATGGATCAACTCAGAAAAGACGC(如SEQ ID NO.3所示)；
[0014]LJ2:TCAATCATTTCGCCCGTCA(如SEQ ID NO.4所示)。
[0015]本专利技术提供一种重组质粒VIGS
‑
GhbHLH121，将基因GhbHLH121序列连接到载体pTRV2所得。
[0016]本专利技术提供一种重组质粒35S
‑
GhbHLH121
‑
GUS，将基因GhbHLH121序列连接到载体pBI121所得。
[0017]本专利技术提供所述基因GhbHLH121、所述扩增引物对或所述重组质粒VIGS
‑
GhbHLH121和35S
‑
GhbHLH121
‑
GUS在基因工程中的应用，特别是在提高棉花和拟南芥缺铁耐受性能力中的应用。尤其是在培育高缺铁耐受性棉花新品种中的应用。
[0018]本专利技术所述的应用，具体方法为GhbHLH121基因克隆、构建过表达载体再通过转基因技术转染到野生型植物品种中。
[0019]本专利技术所述的转基因棉花的构建方法，扩增基因GhbHLH121所用的扩增引物对为：
[0020]LJ1:ATGGATCAACTCAGAAAAGACGC(如SEQ ID NO.3所示)；
[0021]LJ2:TCAATCATTTCGCCCGTCA(如SEQ ID NO.4所示)。
[0022]构建重组质粒VIGS
‑
GhbHLH121所用的扩增引物对为：
[0023]LJ3:5
’
gtgagtaaggttaccgaattcAGATTACCCGGTTGTCATGGCTCC 3
’
[0024]LJ4:5
’
cgtgagctcggtaccggatccCCCGATGATAAATCCTGATCTGCTG 3
’
[0025]本专利技术所述的转基因拟南芥的构建方法，构建重组质粒35S
‑
GhbHLH121
‑
GUS所用的扩增引物对为：
[0026]LJ5:5
’
gaacacgcaggggactctagaATGGATCAACTCAGAAAAGACGC 3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棉花编码bHLH基因GhbHLH121，其序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述棉花编码bHLH基因GhbHLH121在增强棉花、拟南芥缺铁耐受性能力中的应用。3.一组基因GhbHLH121的扩增引物对，其特征在于：包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒沉默权利要求1所述棉花编码bHLH基因GhbHLH...

【专利技术属性】
技术研发人员：关雪莹，李洁，冯守礼，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：