水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用。所述OsFd4基因的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9的方法对水稻基因OsFd4进行敲除，分别对野生型与敲除突变体植株进行白叶枯病原菌接种实验。结果显示，敲除OsFd4明显提高了水稻植株应对细菌型病原菌鞭毛蛋白短肽处理后的活性氧爆发与胼胝质沉积水平，进而增强了水稻对白叶枯病菌的抗性。同时对田间植株形态观察发现，OsFd4敲除突变体的生长状况正常，与野生型相比没有明显差异。上述结果表明，OsFd4为负调控水稻抗白叶枯病免疫的基因。本发明专利技术内容为田间白叶枯病发生时通过基因编辑技术提高水稻抗性提供一种内源基因靶标。高水稻抗性提供一种内源基因靶标。

【技术实现步骤摘要】
水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用。

技术介绍

[0002]水稻(Oryza sativa)是世界上一半以上人口的主食作物，也是作物基因组功能研究的模式物种。水稻在其整个生育期内受到多种病害的威胁，对其产量的稳定造成严重影响。例如，水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)侵染引起的白叶枯病，是世界范围内最具破坏性的水稻细菌性病害，发病严重时可导致减产高达50％。
[0003]铁氧还蛋白(Ferredoxins,Fds)家族具有保守的铁硫[2Fe
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2S]域，分布于质体的基质中，作为最上游的电子载体，将电子分配给下游代谢反应通路的各种受体。根据其表达模式，高等植物中的Fds可分为光合型和非光合型。前者从叶绿体光系统I接收电子，而后者使用氧化戊糖磷酸途径中生成的NADPH作为电子供体。当质体中的主要Fds存在缺陷时，电子传递链受阻，导致过量电子转移到O2或H2O，形成ROS。
[0004]越来越多的研究表明，Fds参与调节植物对各种胁迫的响应。例如，拟南芥中AtFd2约占地上部分Fd总表达量的90％，它的缺失导致叶绿体中ROS的积累。AtFd2敲除突变体(Fd2
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KO)可以通过诱导光保护相关基因表达以更好地适应长期高光条件。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中外源或内源性Fd编码基因的过表达可减少内源性H2O2的产生，并增强对热应激的耐受性。在拟南芥中异源表达甜椒铁氧还蛋白编码基因时也发现了类似的结果。此外，Fds在植物免疫中的调控作用已经被探索，例如在拟南芥或烟草中异源表达的甜椒铁氧还蛋白编码基因可以增强转基因植物对其病原菌的抗性。另有研究结果表明，拟南芥Fd2
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KO突变体对(半)活体营养型病原菌侵染表现出更高的感病性，这可能是由于突变体中茉莉酸及其衍生物的高积累抑制了水杨酸信号通路介导的抗性。
[0005]水稻中有5个典型的Fd蛋白，命名为OsFd1
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OsFd5。OsFd1是水稻中的主要的光合型Fd，其在维持水稻幼苗正常存活方面发挥着重要作用。OsFd4是水稻最主要的非光合类型Fd蛋白，然而OsFd4在水稻中的生物学功能仍不明确。截止目前，尚没有关于水稻Fd蛋白在抗病中功能或应用的报道。本专利技术研究发现，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术使水稻OsFd4基因丧失功能，可提高水稻抗白叶枯病能力，同时不影响水稻植株的正常生长。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用，具体采用CRISPR/Cas9方法对水稻OsFd4基因进行敲除以及进一步的抗性鉴定，明确了OsFd4基因对水稻白叶枯抗性的负调控功能，为防控白叶枯病发生提供可调控的内源基因靶标。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种水稻基因OsFd4，其开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]一种由上述水稻基因OsFd4编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]上述一种水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用，其具体操作包括：在水稻OsFd4基因的开放阅读框编码区中选取两个靶位点，构建OsFd4敲除载体，然后将OsFd4敲除载体转化至根癌农杆菌中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得OsFd4敲除突变体；使用植物病原细菌鞭毛蛋白保守多肽flg22处理野生型和OsFd4敲除突变体植株叶片，检测ROS爆发与胼胝质沉积情况，进一步验证osfd4突变体对白叶枯病原菌的抗性。
[0010]上述两个靶位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0011]水稻基因OsFd4在水稻抗白叶枯病中的应用，敲除OsFd4基因明显提高水稻对白叶枯病的抗性；并且OsFd4敲除突变体响应flg22处理后活性氧爆发水平和胼胝质沉积数量均高于野生型。
[0012]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的水稻基因OsFd4敲除之后，与野生型水稻相比显著提高了抗白叶枯病的能力，该基因为防控白叶枯病发生提供可调控的内源基因靶标。
附图说明
[0013]图1：中间载体SK
‑
gRNA中OsU3:gRNA的结构图。
[0014]图2：双元载体pC1300
‑
Cas9中2
×
35S：Cas9的结构图。
[0015]图3：OsFd4敲除突变体的鉴定。Reference：为参考基因序列；osfd4
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1、osfd4
‑
2与osfd4
‑
3为OsFd4基因纯合突变株系。图4：OsFd4敲除突变体田间生长表型鉴定。ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd4
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1、osfd4
‑
2与osfd4
‑
3：OsFd4基因纯合突变植株；标尺长度：10cm。
[0016]图5：OsFd4敲除突变体接种白叶枯病原菌株Pxo86调查结果。ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd4
‑
1、osfd4
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2与osfd4
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3：OsFd4基因纯合突变植株。a，接种白叶枯病原菌15天后发病叶片(标尺长度：3cm)；b，病斑长度统计；c，相同长度发病叶片中白叶枯菌数目统计。
[0017]图6：flg22诱导OsFd4敲除突变体产生活性氧水平的检测结果。flg22：植物病原细菌鞭毛蛋白保守多肽；H2O：水对照处理；ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd4
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1：OsFd4基因纯合突变植株。
[0018]图7：flg22诱导OsFd4敲除突变体胼胝质检测结果。ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd4
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1：OsFd4基因纯合突变植株；标尺长度：30μm。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。
[0020]实施例1 OsFd4基因的获得利用拟南芥中拟南芥铁氧还蛋白AtFd2的蛋白序列在NCBI数据库中进行序列比对，我们确定基因号为LOC_Os03g61960(OsFd4)的水稻中AtFd2的同源蛋白，其相似度为68％。LOC_Os03g61960基因编码的蛋白长度为153个氨基酸，且其N端具有叶绿体定位信号肽。根据NCBI网站上对水稻品种日本晴基因组中该基因的预测cDNA序列(XM_015774279.1)，我们成功从中花11叶片总cDNA中克隆到OsFd4的开放阅读框，全长462bp，经测序发现与预测序列一致。克隆OsFd4开放阅读框所用引物的核苷酸序列如下：
OsFd4ORF
‑
F(SEQ ID NO.5)：5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水稻OsFd4基因在增强水稻对白叶枯菌抗性中的应用，其特征在于：所述OsFd4基因的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：在水稻OsFd4基因的开放阅读框编码区...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莫，陆民锋，时华，陈锦惠，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：