高效筛选不同拷贝数重组毕赤酵母菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效筛选不同拷贝数毕赤酵母重组菌株的方法，所述方法将含外源基因的重组毕赤酵母菌株进行PTVA法筛选后采用流式细胞仪基于PI染色选择重组菌、发酵诱导培养、检测拷贝数；或者PTVA法筛选后直接进行发酵诱导培养，再采用流式细胞仪进行基于DiOC6(3)染色选择重组菌，检测拷贝数，获得不同拷贝数的毕赤酵母重组菌株。本发明专利技术比传统筛选毕赤酵母不同拷贝数菌株的方法，缩短约三分之一以上，筛到多样性拷贝数的机率提高到90％以上。筛到多样性拷贝数的机率提高到90％以上。

【技术实现步骤摘要】
高效筛选不同拷贝数重组毕赤酵母菌株的方法
(一)

[0001]本专利技术属于酵母菌筛选
，涉及一种毕赤酵母基因工程菌的筛选方法，具体涉及毕赤酵母高拷贝数转化子的快速筛选方法。
(二)
技术介绍

[0002]毕赤酵母表达蛋白的产量受菌株、培养基组成、培养条件的影响。近年来，国内外发表了多篇文章在菌株筛选、培养基组成优化以及诱导条件的改变对于蛋白产量的影响进行深入研究，有学者已经从启动子、诱导过程、溶氧控制、温度控制、pH控制等方面进行了关于毕赤酵母发酵工艺的阐述。这些研究中目的蛋白生产工艺都得到不同程度的改进。随着毕赤酵母基因组的公布以及其他相关组学研究的发展，关于毕赤酵母的菌株的代谢途径改造以及从分子水平来优化蛋白产量的研究得以深入。
[0003]毕赤酵母表达系统重组蛋白产量的优化方法中，研究最为广泛的是提高插入基因的拷贝数以提高转录和翻译的水平，筛选高拷贝菌株是最有效的提高重组蛋白表达量的策略之一。但是拷贝数过高也可能不利于蛋白表达，所以需要通过比较不同拷贝数菌株的发酵性能筛选出最优拷贝数的菌株。因此，获得不同拷贝数的菌株进行比较是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效筛选不同拷贝数毕赤酵母重组菌株的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：(1)将含外源基因的重组毕赤酵母菌株接种至含抗性的培养基中，采用PTVA法筛选抗性重组菌；(2)步骤(1)抗性重组菌的菌液采用流式细胞仪基于PI染色后进行荧光检测，根据荧光强度选择重组菌；(3)步骤(2)筛选的重组菌发酵诱导培养后上清进行拷贝数检测，获得不同拷贝数的毕赤酵母重组菌株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中外源基因包括绿色荧光蛋白eGFP、胶原蛋白肽COL及牛乳铁蛋白肽BlfFf的基因。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)PTVA法筛选方法为：将含外源基因的重组毕赤酵母菌株接种至含G418的YPD培养基中至OD
600
＝0.1，用无菌纱布封口，30℃，220rpm避光培养24h，每24h将G418添加量提高一次，提高幅度为0.1
‑
2倍，当G418添加量使毕赤酵母致死率95％以上，然后结束PTVA，筛选得到抗性重组菌。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)基于PI染色的荧光检测方法为：将抗性重组菌的菌液中加入碘化丙啶作为实验组，同时将灭活的抗性重组菌的菌液中加入碘化丙啶作为阳性对照，以抗性重组菌的菌液为阴性对照，避光孵育后，采用流式细胞仪进行荧光检测，筛选不同荧光强度的重组菌；所述碘化丙啶加入终浓度50μg/mL。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)发酵诱导培养的方法均为：将重组菌接种至BMGY培养基中，30℃，220rpm培养16
‑
24h至OD
600
为4；室温下4500rpm离心5min，收集菌体，用高盐培养基重悬菌体至OD
600
为8；取20ml重悬菌液转移至250ml三角瓶中，用纱布封口，30℃，220rpm摇床培养24h，每12h向高盐培养基中加入无水甲醇至体积终浓度为1％；培养24h后，取1mL菌液，室温12000rpm离心2min，收集上清进行拷贝数检测；所述高盐培养基组成：15g/L酵母粉，0.465g/L CaSO4，7.45g/L MgSO4·
7H2O，11.8g/L KH2PO4，9.1g/L K2SO4，5g/L硫酸铵，10mL/L甲醇，生物素4
×
10
‑4g/L，2mL/L PTM1，溶剂为水；所述PTM1组成：H3BO
3 0.02g/L，CuSO4·
5H2O 6.0g/L，MnSO4·
H2O 3.0g/L，Na2MoO4·
2H2O 0.2g/L，CoCl
2 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl
2 20.0g/L，FeSO4·
7H2O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L H2SO4，ddH2O定容至1L。6.一种高效筛选不同拷贝数毕赤酵母重组菌株的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏春，刘心雨，汪伊静，孙杰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：