一种基于光调控的核酸扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种基于光调控的核酸扩增方法，其包括以下操作步骤：1)向核酸扩增反应体系中加入可光调控的工具酶活性抑制剂，混合配制成预混反应液；所述可光调控的工具酶活性抑制剂包括封闭序列；2)使用UV光对预混反应液进行照射，所述封闭序列中的光响应基团在经光激发后断裂，使封闭序列与所述工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，核酸扩增反应体系中的工具酶催化启动核酸扩增反应。上述方法能够实现核酸扩增反应的精准、快速调控，且是非接触性的，保证了操作的便捷性，能够在时间和空间上实现核酸扩增的精准调控；同时所使用的封闭策略是通用的，适用于所有的扩增反应，不需要根据不同的扩增反应进行调整，节约成本，并简化步骤。并简化步骤。并简化步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光调控的核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，特别是涉及一种基于光调控的核酸扩增方法。

技术介绍

[0002]核酸由大量核苷酸单体聚合而成，是生命体最基本的遗传物质，主要包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。核酸在生命体生长、发育、变异等一系列生命活动中起着至关重要的作用，所以开发基于核酸分子的诊断技术对于疾病的诊断、病原体的鉴定以及癌症的筛查等具有重要意义。1983年，PCR技术的专利技术，极大程度的提高了核酸诊断的灵敏度，使得极低浓度的核酸检测成为可能。随后，1996年荧光定量PCR技术的出现，使得核酸分析从定性检测过渡到了定量分析，并逐渐发展为核酸检测领域的金标准技术。尽管如此，PCR技术依赖于精密的光学仪器、训练有素的操作人员的特性，一定程度上限制了其在资源匮乏地区的大范围推广。因此，为了进一步降低设备依赖性、缩短反应时间，开发了核酸等温扩增技术。核酸等温扩增技术的反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。该技术的广泛应用进一步推动核酸检测领域的快速发展。
[0003]然而，在上述核酸扩增技术中，不论是PCR技术，还是核酸等温扩增技术，其扩增反应所需的核酸酶在低温下具有的残余活性，使得在体系配制的过程中发生低水平的非特异性退火和延伸，形成非特异性扩增产物。
[0004]为了实现核酸酶活性的控制，减少非特异性扩增，热启动核酸扩增技术被开发。该技术主要依赖于抗体相互作用、化学修饰和适配体技术等来实现聚合酶活性的调控，使其在低温条件下丧失活性，进而抑制非特异性扩增现象。然而，适配体和抗体的开发通常需要耗时的文库筛选和费力的优化步骤。此外，不可避免的加热步骤使得该策略无法适用于部分核酸等温扩增技术，例如最佳反应温度在37℃的核酸等温扩增技术。
[0005]另一种常见的策略是设计光激活聚合酶，实现时间和空间上的核酸扩增反应的调控。目前常用的方法是对聚合酶进行改造，在聚合酶中额外引入光敏性的非自然氨基酸。该策略通常需要了解聚合酶的详细结构和机制信息，以实现酶活性的精准调控。因此，成功设计一个合适的光激活酶极具挑战性。近期，一种基于寡核苷酸序列的酶失活方法被报道，作者通过点击化学方法将寡核苷酸链共价连接到酶上，寡核苷酸序列与酶的结合能够将酶失活，而同时修饰了光响应基团(PC
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linker)的寡核苷酸序列能够在UV光照后从酶表面游离到溶液，实现了酶的再活化。然而，该方法中，寡核苷酸序列与酶的结合是通过点击化学反应实现的，这进一步复杂化了实验操作。
[0006]综上所述，发展一种简单、方便、快速、通用的核酸扩增调控方法是本领域的重要研究方向。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的在于，提供一种基于光调控的核酸扩增方法，其具有启动调
控精准、快速且调控操作便捷的优点。
[0008]一种基于光调控的核酸扩增方法，其包括以下操作步骤：
[0009]1)向核酸扩增反应体系中加入可光调控的工具酶活性抑制剂，混合配制成预混反应液；
[0010]所述可光调控的工具酶活性抑制剂包括封闭序列，所述封闭序列为至少具有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，且所述光响应基团具有光照断键特性；封闭序列与核酸扩增反应体系中的工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；
[0011]2)使用UV光对预混反应液进行照射，所述封闭序列中的光响应基团在经光激发后断裂，使所述封闭序列与所述工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，核酸扩增反应体系中的工具酶催化启动核酸扩增反应。
[0012]本专利技术实施例所述基于光调控的核酸扩增方法，其通过可光调控的工具酶活性抑制剂的加入，利用所述工具酶活性抑制剂的封闭序列中含有硫代磷酸(PS)和光响应基团两种修饰，硫代磷酸修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物与蛋白稳定结合后能够沉默该蛋白活性；光响应基团是一种光敏性基团，其具有光照断键特性，在受到UV光照后，光响应基团被光切割，自封闭序列中脱落，使封闭序列断裂为核苷酸小片段并与蛋白分离。因此，在核酸扩增启动前，在预混反应液中所述工具酶活性抑制剂与核酸扩增反应体系中的工具酶形成蛋白核酸复合物后，封闭序列中所修饰的PS能够沉默蛋白的活性，在需要启动扩增反应时，只需进行UV光照即可使封闭序列中的光响应基团断键，封闭序列断裂为核苷酸小片段，断裂后的核苷酸小片段与蛋白的结合稳定性降低，使得核苷酸小片段也从蛋白表面游离到反应体系中，最终实现蛋白的去失活，核酸扩增反应体系中的工具酶进而能够对反应进行催化，启动核酸扩增反应。
[0013]本专利技术实施例的调控方法能够实现核酸扩增反应的精准、快速的调控，且该调控方法是非接触性的，即不需要开盖，保证了操作的便捷性，能够在时间和空间上实现核酸扩增的精准调控；同时所使用的封闭策略是一种通用的酶活性封闭方法，适用于所有的扩增反应，不需要根据不同的扩增反应进行调整，节约了实验成本，简化了实验步骤。另外，所述封闭序列中带有的PS修饰能够增加封闭序列的稳定性，使其能够耐受核酸酶的降解，进一步拓宽了其应用范围。
[0014]进一步地，所述核酸扩增反应体系可为PCR扩增反应体系或等温扩增反应体系；所述等温扩增反应体系选自重组酶聚合酶等温扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶恒温扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增(EXPAR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、嵌合引物引发的核酸等温扩增(ICAN)、链交换扩增技术(SEA)、SSB
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解旋酶介导的快速PCR(SHARP)中的一种。
[0015]进一步地，所述封闭序列为单碱基重复序列或随机碱基序列，其长度为5～200nt。
[0016]进一步地，所述光响应基团为光可裂解的基团，具体可以为PC
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linker，其作为光敏基团能够在自然光下保持稳定，使其不受制样环境的限制；所述光响应基团为嵌入修饰于所述封闭序列内，便于在光照断键后将所述封闭序列切割成若干个小片段，从而更好地与基因工程核酸酶脱离，以恢复其活性。
[0017]进一步地，所述封闭序列中光响应基团的修饰个数为3～199个。
[0018]进一步地，所述封闭序列中，每隔1～50个碱基嵌入修饰一个光响应基团。
[0019]进一步地，所述封闭序列中硫代磷酸的修饰位点个数为4～199个。
[0020]进一步地，所述封闭序列可为单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、DNA和RNA形成的杂合双链或DNA和RNA形成的嵌合链。
[0021]进一步地，步骤1)的所述预混反应液中，核酸序列与工具酶的摩尔浓度比为0.01～100：1；步骤2)中UV光照射的时间为5s～30min。
[0022]为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于光调控的核酸扩增方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1)向核酸扩增反应体系中加入可光调控的工具酶活性抑制剂，混合配制成预混反应液；所述可光调控的工具酶活性抑制剂包括封闭序列，所述封闭序列为至少具有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，且所述光响应基团具有光照断键特性；封闭序列与核酸扩增反应体系中的工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；2)使用UV光对预混反应液进行照射，所述封闭序列中的光响应基团在经光激发后断裂，使所述封闭序列与所述工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，核酸扩增反应体系中的工具酶催化启动核酸扩增反应。2.根据权利要求1所述的基于光调控的核酸扩增方法，其特征在于：所述核酸扩增反应体系可为PCR扩增反应体系或等温扩增反应体系；所述等温扩增反应体系选自重组酶聚合酶等温扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶恒温扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增(EXPAR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、嵌合引物引发的核酸等温扩增(ICAN)、链交换扩增技术(SEA)、SSB
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解旋酶介导的快速PCR(SHARP)中的一种。3.根据权利要求1所述的基于光调控的核酸扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，胡梦露，张冰妮，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：