可拉酸降解酶的高效表达及其在特定分子量可拉酸寡糖制备中的应用制造技术

本发明专利技术适用于可拉酸纯化生产领域，提供了一种可拉酸降解酶的高效表达及其在特定分子量可拉酸寡糖制备中的应用。本发明专利技术通过对CAH蛋白序列进行不同长度截短实现了CAH不同表达量生产。本发明专利技术通过添加不同融合蛋白有效地实现了CAH蛋白的高效表达。本发明专利技术通过三维建模发现了第310

【技术实现步骤摘要】
可拉酸降解酶的高效表达及其在特定分子量可拉酸寡糖制备中的应用


[0001]本专利技术属于可拉酸生产领域，尤其涉及一种可拉酸降解酶的高效表达及其在特定分子量可拉酸寡糖制备中的应用。

技术介绍

[0002]可拉酸(Colanic acid，CA)是一种细菌胞外多糖，由大多数大肠杆菌菌株以及肠杆菌科的其他物种产生，是菌体在生命活动过程中为了适应环境的变化、提高自身生存几率而合成的多糖。CA 分子量较大，松散地包裹在菌体表面，使得菌体显示粘液状态，防止细胞失水、保护细胞同时抵御有害物质。在不利于生长的环境条件下，例如干燥、低压及低pH，粘液化菌株比野生菌株具有更强的生存力。2017年，Han等报道通过喂养纯化的CA或喂养可分泌CA的大肠杆菌，能够明显延长秀丽杆线虫的寿命。此外，CA作为一种独特的活性生物聚合物，具有特殊的生物学特性和生理参数，具有广泛的应用前景。例如，CA由于其多孔的纤维素结构和位于胶体表面的大量亲水基团，是一种天然的水凝胶，具有优异的补水能力和柔软的质地，是未来化妆品和医疗保健市场的良好候选产品。
[0003]在以斑马鱼为模型的体内研究中发现，含有岩藻糖的多糖或寡糖具有明显的抗炎功能。另有研究表明，岩藻糖分子或者含有岩藻糖的多糖或寡糖可以更加容易渗入真皮中，增加皮肤厚度以及促进胶原结构更加细密化，因此岩藻糖及富含岩藻糖的多糖或寡糖可以减缓皮肤衰老。而CA是由D
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葡萄糖、L
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岩藻糖、D
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半乳糖、D
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葡萄糖醛酸以及侧链上非化学计量修饰的O
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乙酰和丙酮酸组成，其中L
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岩藻糖含量高达约30％，这意味着CA在抗炎、增强免疫力及抗衰老等方面将具有巨大的应用潜力。
[0004]当前对于CA的报道主要集中于大分子的产品，对于小分子量的CA还没有系统的研究。根据对其他种类多糖的研究发展分析，在将来若需要进一步挖掘CA的作用机制以及拓展其在各个领域的应用，需要进一步研究特定分子量的CA寡糖。比如，根据对透明质酸的研究，在以前的研究中主要集中于大分子量的透明质酸的研究及其在化妆品领域的应用，但是近些年来通过进一步对小分子量透明质酸的研究发现其不仅在护肤品中可以有更宽广的应用，而且进一步可以应用到医疗等领域。而为了得到CA寡糖，首先需要挖掘和表达能够降解CA的降解酶。然后基于CA降解酶(Colanic acid hydrolase,CAH)进一步研究该酶对CA的降解规律，从而利用降解工艺及纯化制备工艺获取特定分子量寡糖，该特定分子量的寡糖将来在护肤品、医疗保健和临床医药中将会有广阔的应用前景。
[0005]肠杆菌在一定条件下合成的可拉酸分子量较大，大约在800
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1000万Da，这种大分子量的多糖在化妆品，保健食品等领域有一定的应用。但是分子量过大存在着相应的问题：
[0006]1.分子量太大造成粘稠度太高，一定浓度下的可拉酸几乎不具有流动性，实际使用造成困难。
[0007]2.分子量过大的可拉酸在护肤品中应用具有强大的保水功能，但是由于分子量太大在一定程度上阻止了可拉酸深入真皮，影响发挥生理功能。
[0008]3.大分子量的可拉酸往往是不同大小分子量的混合物，而对于医药等相关研究与应用需要明确化合物的结构，因此当前这种混合物状态的可拉酸多糖其进一步在医药领域的应用存在一定阻碍。
[0009]4.当前未见有对可拉酸降解酶高效表达的报道，同时也未见利用可拉酸降解酶制备特定分子量可拉酸寡糖的报道。
[0010]在2010年，Firozi等(Gene Therapy,2010,17(12:1484
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1499)挖掘了一个可以降解CA的降解酶，但是在后来并没有见到相关系统的对该酶进行研究的报道，也没有制备特定分子量CA寡糖的报道。因此，进一步开发该降解酶有着重要意义，同时为获取特定分子量可拉酸寡糖提供技术手段。

技术实现思路

[0011]本专利技术在于提供一种可拉酸降解酶的高效表达及其在特定分子量可拉酸寡糖制备中的应用。利用CAH制备特定分子量可拉酸寡糖，为可拉酸将来的深入研究提供可靠的不同分子量产品。
[0012]本专利技术的第一个目的，在于提供一种可拉酸降解酶的高效表达序列，如SEQ ID No.2所示。
[0013]本专利技术的第二个目的，在于提供一种可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，包括：
[0014](1)序列的获取，人工合成了CAH表达基因的第108
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790号氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；
[0015](2)表达载体的构建：将目标序列插入到质粒的BamHI/HindIII酶切位点之间得到CAH表达质粒；将CAH表达质粒转入出发菌株中，摇瓶培养表达CAH蛋白，检测酶活；
[0016](3)不同长度截短序列对酶活的影响：将CAH表达序列分别按预定长度的氨基酸进行截短表达，得到对应数量的重组质粒，将重组质粒转入出发菌株得到重组菌，摇瓶培养表达CAH蛋白，检测酶活；
[0017](4)不同融合蛋白对CAH表达的影响：根据上述获得酶活最高的重组菌，在该截短对应数量氨基酸的序列基础上，在N端分别添加GST、MBP、SUMO、TrxA、DsbA、NusA；分别得到对应重组菌株；检测对应的酶活；
[0018](5)半理性设计提高CAH蛋白酶活：选取步骤(4)最高蛋白表达量的重组菌株；进行蛋白三维建模，以可拉酸六糖单元为底物进行分子对接，分析在底物结合口袋附近的特定序列，对改特定序列进行随机突变，得到一个含有转化子的突变库，进行培养，筛选得到高表达CAH的工程菌。
[0019]特别地，步骤(2)中，质粒为出发菌株的通用质粒；所述出发菌株为大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌。
[0020]更进一步地，将目标序列插入到pET20b质粒的BamHI/HindIII酶切位点之间得到CAH表达质粒pET20b
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CAH。
[0021]特别地，步骤(3)中，将CAH表达序列分别按10个氨基酸，20个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸，80个氨基酸，90个氨基酸，100个氨基酸进行截短表达，得到对应重组质粒。
[0022]特别地，步骤(5)中，选取步骤(4)最高蛋白表达量的重组菌株；进行蛋白三维建模，以可拉酸六糖单元为底物进行分子对接，分析在底物结合口袋附近的特定序列，对改特定序列进行随机突变，得到一个含有12000个转化子的突变库，利用96孔板进行培养，筛选得到高表达CAH的工程菌。
[0023]最优选的，可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，包括以下步骤：
[0024](1)序列的获取，人工合成了CAH表达基因的第108
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790号氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；
[0025](2)表达载体的构建：将目标序列插入到pET20b质粒的BamHI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可拉酸降解酶的高效表达序列，其特征在于，如SEQ ID No.2所示。2.可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，包括：(1)序列的获取，人工合成了CAH表达基因的第108
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790号氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；(2)表达载体的构建：将目标序列插入到质粒的BamHI/HindIII酶切位点之间得到CAH表达质粒；将CAH表达质粒转入出发菌株中，摇瓶培养表达CAH蛋白，检测酶活；(3)不同长度截短序列对酶活的影响：将CAH表达序列分别按预定长度的氨基酸进行截短表达，得到对应数量的重组质粒，将重组质粒转入出发菌株得到重组菌，摇瓶培养表达CAH蛋白，检测酶活；(4)不同融合蛋白对CAH表达的影响：根据上述获得酶活最高的重组菌，在该截短对应数量氨基酸的序列基础上，在N端分别添加GST、MBP、SUMO、TrxA、DsbA、NusA；分别得到对应重组菌株；检测对应的酶活；(5)半理性设计提高CAH蛋白酶活：选取步骤(4)最高蛋白表达量的重组菌株；进行蛋白三维建模，以可拉酸六糖单元为底物进行分子对接，分析在底物结合口袋附近的特定序列，对改特定序列进行随机突变，得到一个含有转化子的突变库，进行培养，筛选得到高表达CAH的工程菌。3.根据权利要求2所述的可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，质粒为出发菌株的通用质粒；所述出发菌株为大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求3所述的可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，将目标序列插入到pET20b质粒的BamHI/HindIII酶切位点之间得到CAH表达质粒pET20b
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CAH。5.根据权利要求2所述的可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将CAH表达序列分别按10个氨基酸，20个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸，80个氨基酸，90个氨基酸，100个氨基酸进行截短表达，得到对应重组质粒。6.根据权利要求2所述的可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，选取步骤(4)最高蛋白表达量的重组菌株；进行蛋白三维建模，以可拉酸六糖单元为底物进行分子对接，分析在底物结合口袋附近的特定序列，对改特定序列进行随机突变，得到一个含有12000个转化子的突变库，利用96孔板进行培养，筛选得到高表达CAH的工程菌。7.根据权利要求2
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6任一所述的可拉酸降解酶的高效表达序列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)序列的获取，人工合成了CAH表达基因的第108
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790号氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；(2)表达载体的构建：将目标序列插入到pET20b质粒的BamHI/HindIII酶切位点之间得到CAH表达质粒pET20b
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CAH；(3)不同长度截短序列对酶活的影响：将CAH表达序列分别按10个氨基酸，20个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸，80个氨基酸，90个氨基酸，100个氨基酸进行截短表达，得到重组重组质粒pET20b
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Δ10CAH、pET20b
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Δ20CAH、pET20b
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Δ30CAH、pET20b
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Δ40CAH、pET20b
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Δ50CAH、pET20b
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【专利技术属性】
技术研发人员：金学荣，钟超，崔俊锋，李佳明，何世琪，罗明明，赵裕栋，
申请(专利权)人：深圳柏垠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：