循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片及其制备方法，包括相互键合的PDMS基片和载玻片，其微流道包括进液流道、阵列式泳道和出液流道，泳道沿其轴向等间距分布有数个微流凹槽阵列单元，微流凹槽阵列单元包括沿泳道轴向等间距依次分布的第一微流凹槽阵列至第六微流凹槽阵列，第一微流凹槽阵列由L个W型微流凹槽沿泳道轴向等间距排布而成，W型微流凹槽的横向尺寸与泳道横向尺寸相等；第i微流凹槽阵列的结构以串联的双W型微流凹槽为偏移主体，基于第一微流凹槽阵列沿泳道横向偏移第i预设尺寸得到，且偏移的方向相同；载玻片的内表面负载有捕获探针。本发明专利技术的微流控芯片的CTC细胞捕获率≥95％、CTC细胞的富集纯度≥80％。80％。80％。

【技术实现步骤摘要】
循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片及其制备方法。

技术介绍

[0002]肿瘤检测，从早期良恶性筛查、手术治疗以及各种常规放化疗以及靶向与免疫用药治疗，贯穿整个发病与治疗周期。常规成像技术，如PET
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CT以及MRI等，可用于初步确认恶性肿瘤的发生，但是临床精准确诊以及临床治疗方案的制定需要同时进行患者组织进行IHC检测，即侵入性组织活检。然而就目前检测方法而言，IHC检测对取样要求较高，且存在一定主观性与异质性，受检测抗体质量、检测过程(如固定、染色)等因素影响；同时，部分肿瘤患者中晚期肿瘤组织很难获取，所以IHC检测虽然是目前临床肿瘤患者检测的金标准，由于上述原因仍然存在着一定的局限性。
[0003]近年来，液体活检(liquid biopsies)由于其非侵入性和采样过程简单对癌症筛查与辅助诊断越来越有吸引力。液体活检与传统的组织活检相比是一项革命性的技术，它可以呈现肿瘤的静态快照，具有独特而巨大的优势；它提供了关于“实时”癌症负担的信息，并揭示了疾病随时间的演变和异质性。液体活检的主要目标包括循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和细胞外囊泡。从原发或转移性癌症进入血液的肿瘤细胞被称为CTC。
[0004]CTC分离技术根据细胞本身的物理特性或表面表达的特异性抗原可分为两大类。每一类又衍生出不同的方法，其中膜过滤、密度梯度离心、免疫亲和力是比较常用的方法，但单一的方法有其独特的优点也有其不足之处。膜过滤是依据细胞大小来分离CTC的方式，在过滤孔径的选择中会相应的丢失一部分CTC；密度梯度离心是依据细胞间密度差异的原理将CTC富集在单核细胞层中，缺点是白细胞不能轻易的被去除。免疫亲和力是依据CTC表面特异性抗原与捕获抗体的特异性结合来富集CTC的方式，缺点是全血样本存在红细胞、白细胞等各类干扰，会影响CTC与捕获抗体的特异性结合以及结合后的分离。分离富集的CTC细胞进一步通过免疫细胞化学与免疫荧光或其他技术进行鉴定。
[0005]随着CTC分离和捕获技术不断的更新迭代，富集效率和纯度也不断提高。其中，基于微流控芯片的CTC富集捕获平台的开发是近年来CTC液体活检领域研究的热点；它不仅可以利用细胞物理特性差异(如大小差异与电荷差异)以及组合微流体力学(如剪切力组合模式)进行CTC细胞分离，还可以利用细胞表面抗原与微流控芯片基底层的功能化修饰捕捉抗体以进行免疫亲和力组合分离CTC。由于微流控芯片腔室几何结构根据CTC细胞与芯片内腔接触的比表面积设计，芯片内腔反应体积一般控制10
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100微升，且通过芯片腔室的微流体力学与角度的设计调整，更能完整保持富集到CTC细胞形态，因此与常规负向免疫磁珠或正向的疫磁珠富集CTC相比，具有血液样本用量少、成本低、CTC富集捕获灵敏与特异性高的特点。
[0006]目前市场上CTC
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chip、HB
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Chip和CTC
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iChip是基于微流控芯片富集的最具有代表性的CTC捕获鉴定平台，这些平台微流控芯片的设计通过CTC靶细胞表面特定抗原与微流控
通道表面结构修饰的生物活性分子蛋白抗体以及核酸配体，利用免疫亲和力进行CTC细胞的捕获富集，或者通过CTC细胞物理特性与电荷分布结合微流控芯片内腔微流体力学设计并通过调整剪切力方向与大小，从而进行CTC细胞的富集分离。
[0007]随着微纳芯片制造技术的发展，通过设计改造微流控芯片构造来增强CTC富集效率成为可能。典型的微流体装置设计成凹槽人字形(HB，grooved herringbone)结构，已经被证明可以分离富集CTC，通过拉伸HB结构与改变微流体的流线模式改变细胞表面相互作用，从而使CTC捕捉率高达93％，且纯度接近14％。随后据此开发了HB微流控设计的各种衍生微流控芯片产品，例如，通过将纳米结构设计(包括纳米柱和纳米尼龙搭扣)并入微流体芯片以增加总表面积并增强细胞表面相互作用；这些微流控结构设计显示了更好的CTC捕获效率。然而，基于凹槽HB微流控芯片构造的一个主要限制是微流道中的剪切应力分布不均匀，导致白细胞(WBC)捕获在具有极低剪切应力的区域中，而牺牲了微流控芯片的CTC富集捕捉的纯度。

技术实现思路

[0008]基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本专利技术的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本专利技术的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片及其制备方法。
[0009]为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，包括相互键合的PDMS基片和载玻片；PDMS基片的内表面具有微流道，微流道与载玻片的内表面形成微流体通道，所述微流道包括进液流道、阵列式泳道和出液流道，阵列式泳道包括等间距并列分布的N条泳道，各条泳道的入口和出口分别与进液流道和出液流道连通；其中，N为整数；
[0011]所述泳道沿其轴向等间距分布有数个微流凹槽阵列单元，微流凹槽阵列单元包括沿泳道轴向等间距依次分布的第一微流凹槽阵列至第六微流凹槽阵列，第一微流凹槽阵列由L个W型微流凹槽沿泳道轴向等间距排布而成，W型微流凹槽的对称轴与泳道轴向的对称轴重合，W型微流凹槽的W开口朝向泳道的进液口，W型微流凹槽的横向尺寸与泳道横向尺寸相等；
[0012]第i微流凹槽阵列的结构以串联的双W型微流凹槽为偏移主体，基于第一微流凹槽阵列沿泳道横向偏移第i预设尺寸得到，且偏移的方向相同；其中，第i预设尺寸为i*D/6，i取值为2～6的整数，D为泳道横向尺寸；
[0013]所述载玻片的内表面对应于微流体通道负载有捕获探针。
[0014]作为优选方案，所述进液流道为树根状结构，包括沿进液流向依次连通的主分支流道、次分支流道和泳道连接流道，主分支流道的入口与PDMS基片的进液口连通。
[0015]作为优选方案，所述主分支流道、次分支流道和泳道连接流道均为弧形流道结构。
[0016]作为优选方案，所述进液流道的对称轴与阵列式泳道的轴向对称轴重合。
[0017]作为优选方案，所述捕获探针为双功能交联剂、链霉亲和素、以及生物素化单克隆抗体依次偶联。
[0018]作为优选方案，所述捕获探针还包括有生物素化的肿瘤关键标志物抗体。
[0019]作为优选方案，所述生物素化的肿瘤关键标志物抗体包括生物素化的EpCAM抗体、
生物素化的CSV抗体与生物素化VIM(vimentin)抗体中的至少一种。
[0020]作为优选方案，所述N取值为4～10中的偶数，L取值为8～15。
[0021]作为优选方案，循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，循环肿瘤细胞的捕获率≥95％，循环肿瘤细胞的富集纯度≥80％。
[0022]本专利技术还提供如上任一项方案所述的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，包括相互键合的PDMS基片和载玻片；PDMS基片的内表面具有微流道，微流道与载玻片的内表面形成微流体通道，其特征在于，所述微流道包括进液流道、阵列式泳道和出液流道，阵列式泳道包括等间距并列分布的N条泳道，各条泳道的入口和出口分别与进液流道和出液流道连通；其中，N为整数；所述泳道沿其轴向等间距分布有数个微流凹槽阵列单元，微流凹槽阵列单元包括沿泳道轴向等间距依次分布的第一微流凹槽阵列至第六微流凹槽阵列，第一微流凹槽阵列由L个W型微流凹槽沿泳道轴向等间距排布而成，W型微流凹槽的对称轴与泳道轴向的对称轴重合，W型微流凹槽的W开口朝向泳道的进液口，W型微流凹槽的横向尺寸与泳道横向尺寸相等；第i微流凹槽阵列的结构以串联的双W型微流凹槽为偏移主体，基于第一微流凹槽阵列沿泳道横向偏移第i预设尺寸得到，且偏移的方向相同；其中，第i预设尺寸为i*D/6，i取值为2～6的整数，D为泳道横向尺寸；所述载玻片的内表面对应于微流体通道负载有捕获探针。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，其特征在于，所述进液流道为树根状结构，包括沿进液流向依次连通的主分支流道、次分支流道和泳道连接流道，主分支流道的入口与PDMS基片的进液口连通。3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，其特征在于，所述主分支流道、次分支流道和泳道连接流道均为弧形流道结构。4.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞捕获用微流控芯片，其特征在于，所述进液流道的对称轴与阵列式泳道的轴向对称轴重合。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张开山，于杰，田华，
申请(专利权)人：杭州华得森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：