一种免疫检测方法及系统技术方案

一种免疫检测方法及系统，该方法包括：检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。本发明专利技术通过水力聚焦，从物理原理上实现数字化分割，不需要微孔板耗材，同时固相载体用量更少，方便易获取，可以实现5个数量级的动态检测范围。动态检测范围。动态检测范围。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫检测方法及系统


[0001]本专利技术涉及单分子免疫检测
，具体涉及一种免疫检测方法及系统。

技术介绍

[0002]随着科学技术发展和人类探索的进度，科研和临床领域对重大疾病相关的早期生物标志物的检测有着迫切的需求。这些生物标志物在疾病发生的早期阶段含量较低，如对阿尔兹海默症有指向意义的神经标志物，由于人体血脑屏障的存在，在血浆中的含量要比脑脊液中低三四个数量级，如何检测痕量标志物对现有传统方法是一个极大的挑战。
[0003]传统的检测方法，如用于蛋白质检测的化学发光法、酶联免疫显色法的检测均在一容积为数百微升的反应池中进行，检测整个反应池内溶液所产生的光信号。一般而言，反应池中有数十万甚至百万以上数量的被测蛋白，在光子计数器的检测下，信号很容易被检测出。
[0004]当样品中的被测蛋白浓度低至一定程度时，如数千以及数万的水平，此时反应池中被测蛋白所发出的光信号将会被背景噪声所掩盖，如溶液分子的热运动引起的光子损耗、探测器件的热噪声、背景杂散光的影响等，导致不能检测到有效信号。因此传统检测方法在检测极低浓度样本时，由于系统背景噪声的存在，检测的精度受到的限制，难以实现高灵敏度的检测。为此单分子检测技术应运而生。
[0005]单分子检测是一种全新的检测理念，起源于数字ELISA及数字PCR技术，其核心在于将极低浓度的磁珠免疫复合物通过物理手段分离出来，在极低浓度被测蛋白反应体系下，大部分磁珠未捕获到抗原或捕获到1个抗原，小部分磁珠捕获到2个或多个抗原，捕获到特定个数抗原的磁珠所占比例符合泊松分布理论。分离出的单个磁珠免疫复合物进行信号增强(数字PCR为核酸扩增)，从而实现对个体被测蛋白的检测。
[0006]目前市面上有两种主流的单分子检测方法，一种是飞升微阵列(Femtoliter array)的方式，即将反应后的磁珠免疫复合物通过重力作用沉降到一个刻蚀有数十万个凹坑的微孔板，每个凹坑的容积在飞升水平，正好容纳单个磁珠，当磁珠进入凹坑后，表面用油封处理，这样通过微孔板上间隔分布的凹坑在空间上将反应物分为成了数十万份。每个凹坑中磁珠上结合的酶将凹坑中的底物进行激发以产生光信号，通过CCD或者CMOS等成像设备对微孔板进行拍照，通过分析所拍图像中凹坑的荧光信号进行分析。该方式的不足包括：1)飞升微孔板的制造工艺复杂以及作为耗材成本高昂，不利于普及，其二是单个凹坑所发出的光信号较弱，需要增加CCD或者CMOS的曝光时间；2)增加了检测时间；3)需要增加制冷装置以避免高曝光时间带来的暗计数增加，这在一定程度上也增加了仪器的复杂度和成本。
[0007]现有技术中，有的通过聚焦光斑的微小检测区域来实现被测蛋白数字化个体检测。该方式的不足在于无法预测荧光免疫复合物的位置，随机性大，且扫描和检测光路设计实现复杂，精度要求高，难以推广。
[0008]综上所述，现有的单分子检测技术存在检测系统复杂、检测设备以及耗材昂贵等
缺陷，如飞升微孔板的精密度要求高等所带来的成本高昂，难以大量推广的问题。这些问题极大程度地阻碍了单分子检测技术在科研和医疗诊断市场中的应用。

技术实现思路

[0009]根据第一方面，在一实施例中，提供一种免疫检测方法，包括：
[0010]检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
[0011]计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
[0012]根据第二方面，在一实施例中，提供一种免疫检测系统，包括：
[0013]检测模块，用于在鞘流作用下，使得包含载体免疫复合物的待测溶液流经检测区，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，采集检测区固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
[0014]计算步骤，用于根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
[0015]根据第三方面，在一实施例中，提供一种免疫检测装置，包括：
[0016]存储器，用于存储程序；
[0017]处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面任意一项所述的免疫检测方法。
[0018]根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面任意一项所述的免疫检测方法。
[0019]根据第五方面，在一实施例中，提供一种免疫检测系统，包括：
[0020]鞘流形成模块，用于形成层流，使得待测溶液中的载体免疫复合物在鞘流包裹下经过检测区，所述载体免疫复合物包含可提供散射信号的固相载体、可提供发光信号的发光材料以及待测物；
[0021]激光发光检测模块，用于激发经过检测区的载体免疫复合物产生散射信号和发光信号；
[0022]以及算法分析模块，用于分析所述激光发光检测模块产生的信号所形成的散点图，根据所述散点图中的散射信号和发光信号，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
[0023]根据第六方面，在一实施例中，提供一种载体免疫复合物，包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
[0024]所述第一结合物结合至所述固相载体；
[0025]所述第一结合物特异性结合至所述待测物的第一位点，所述第二结合物特异性结合至所述待测物的第二位点。
[0026]根据第七方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含第六方面任意一项的载体免疫复合物。
[0027]依据上述实施例的一种免疫检测方法及系统，本专利技术通过水力聚焦，从物理原理上实现数字化分割，不需要微孔板耗材，同时固相载体用量更少，方便易获取。
[0028]在一实施例中，可以实现5个数量级的动态检测范围。
[0029]在一实施例中，可通过改变磁珠的特征，如包被多种荧光染料即能够实现高通量、多标志物的检测。
附图说明
[0030]图1为一种实施例的磁珠反应示意图；
[0031]图2为一种实施例的鞘流检测示意图；
[0032]图3为一种实施例的检测光路示意图；
[0033]图4.1为单独磁珠的散点图；
[0034]图4.2为0.02pg/mL样本的散点图；
[0035]图4.3为抗原浓度为0.1pg/mL时的散点图；
[0036]图4.4为抗原浓度为2pg/mL时的散点图；
[0037]图4.5为抗原浓度为200pg/mL时的散点图；
[0038]图5为一种实施例中AFN与抗原浓度的定标曲线图。
具体实施方式
[0039]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫检测方法，其特征在于，包括：检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。2.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，计算平均每个固相载体结合的发光材料数量AFN(Average Fluor ophore Number)，根据所述AFN，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。3.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，根据如下公式计算得到平均固相载体结合发光材料个数AFN：AFN＝
‑
ln(1
‑
R)
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(1)；优选地，检测步骤中，所述载体免疫复合物包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；所述第一结合物结合至所述固相载体；所述第一结合物特异性结合至所述待测物的第一位点，所述第二结合物特异性结合至所述待测物的第二位点；优选地，检测步骤中，所述待测物包括蛋白，所述第一结合物包括捕获抗体，用于特异性结合至所述待测物的第一位点；优选地，所述待测物包括核酸，所述第一结合物包括用于捕获所述核酸的探针；优选地，所述第二结合物包括检测抗体，用于特异性结合至待测物的第二位点；优选地，所述发光材料包括荧光团或上转换光致发光材料；优选地，所述荧光团包括具备光谱发射特性的标记物；优选地，所述荧光团包括荧光染料、荧光微球、量子点中的至少一种。4.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，所述固相载体包括磁珠、微粒中的至少一种；优选地，所述磁珠的粒径≤3μm；优选地，所述检测步骤中，所述载体免疫复合物在鞘流包裹下经过检测区；优选地，所述检测步骤中，所述载体免疫复合物在鞘流包裹下逐个经过检测区；优选地，所述检测步骤中，反应体系中固相载体的数目与待测物数目的比值≥5；优选地，所述检测步骤中，采集检测区的固相载体的散射信号M时，所述固相载体包括载体免疫复合物中的固相载体以及游离的固相载体。5.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测步骤中的载体免疫复合物的制备方法包括：第一复合物制备步骤，包括将第一结合物固化至固相载体，将固化有第一结合物的固相载体与待测样本混合，所述第一结合物特异性结合至待测样本中的待测物的第一位点，获得复合有固相载体、第一结合物、待测物的第一复合物；
第一清洗步骤，包括将所述固相载体固定，清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵汉荣，
申请(专利权)人：深圳远瑞生物医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：