甲醛检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用技术

本发明专利技术公开了一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用。检测甲醛的免疫分析方法，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工抗原2。苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛转化为苯并咪唑；应用本发明专利技术的抗体构建间接检测食品中甲醛的酶联免疫分析，对甲醛检测限为20.91ng/mL，半抑制浓度为137.38ng/mL，对邻苯二胺以及其他甲醛结构类似物交叉反应很低，均小于0.2％，可有效的排除其类似物的干扰，该方法具有检测灵敏度高，特异性高、检测通量高等优势，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
甲醛检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，更具体地，涉及一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用。

技术介绍

[0002]甲醛是一种无色、易挥发具有刺激性气味的物质，具有较高的毒性，易溶于水，其水溶液俗称“福尔马林”，常用作防腐剂和消毒剂。日常生活当中能接触到的甲醛最主要的来源于工业生产排放、建筑物室内装修以及家具材料所释放、人们日常生活当中燃烧矿物质所排放以及人为添加了甲醛或者被甲醛污染的食品。
[0003]甲醛已经被世界卫生组织确认为致畸、致癌物质，存在潜在的导致基因突变性，长期接触将极大的威胁人类健康，尤其是对儿童、孕妇造成的影响更大，过量的甲醛则会损伤中枢神经系统，引发过敏性肺炎、心血管疾病和癌症等疾病。因此准确测定生物体内甲醛的含量，防止其过量摄入或集聚，对人体健康具有重要意义。
[0004]甲醛为国家明文规定的禁止在食品中使用的添加剂，在食品中不得检出，对人体会产生较大的危害，同时也是一种致癌物质。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，将甲醛放在一类致癌物列表中。2019年7月23日，我国生态环境部将甲醛列入有毒有害水污染物名录(第一批)。
[0005]目前，甲醛的检测方法较多，主要有分光光度法、比色法、气相色谱法、液相色谱法、荧光探针法等。这些方法的检出限主要在0.06～1.2mg/kg之间，但这些方法都有着各自的优缺点，分光光度法通常选择性差，灵敏度低，比色法虽分析速度快但缺乏特异性，而色谱法样品处理相对复杂，这些方法都不适宜进行大批量的快速筛选，因此，需专利技术一种针对甲醛的快速、简便的检测方法。
[0006]基于抗原抗体特异性结合的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。国际权威学术刊物将其列为近年来首位优先发展的新分析技术。但是由于甲醛分子太小，抗原特征表位不明显，目前尚无可用于检测甲醛的半抗原、抗原和抗体及免疫检测方法的报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是克服现有技术中甲醛检测技术的缺陷和不足，提供一种甲醛的免疫分析检测方法、甲醛半抗原、人工抗原和抗体及其应用，苯并咪唑为甲醛与邻苯二胺衍生反应的产物，通过添加过量的邻苯二胺即可将甲醛完全反应。通过检测苯并咪唑可以间接检测甲醛的含量。
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0009]第一方面，一种检测甲醛的免疫分析方法，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；其中，
[0010]所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工
抗原2；式IV如下：
[0011]式V如下：
[0012]优选地，所述免疫分析方法以人工抗原2为包被原，以人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0013]优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0014]一种检测甲醛的免疫分析方法，将甲醛与邻苯二胺充分反应转化为苯并咪唑，以人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体，通过标准加入校准曲线法对样品中的甲醛进行定量测定。
[0015]优选地，以人工抗原2为包被原，以人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0016]优选地，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原2为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0017]作为上述方法的具体实施方式，包括如下步骤：
[0018](1)利用人工抗原2免疫动物制备单克隆抗体；
[0019](2)将人工抗原2作为包被原包被在微孔板上，然后将步骤(1)制备得到多克隆抗体加入微孔板中；
[0020](3)加入甲醛充分衍生后的苯并咪唑待测样品，采用竞争ELISA测定苯并咪唑的含量，从而间接测定甲醛的含量，苯并咪唑与甲醛的摩尔比为1：1。
[0021]优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)。
[0022]优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。
[0023]优选地，偶联鸡卵清白蛋白的人工抗原2包被浓度为1μg/mL，甲醛抗体稀释倍数为4000倍。
[0024]所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫分析、免疫传感、免疫胶体金等。
[0025]第二方面，5
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氨基苯并咪唑和/或5
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羧基苯并咪唑作为半抗原在制备甲醛人工抗
原和/或甲醛抗体中的应用。
[0026]已知，5
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氨基苯并咪唑和5
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羧基苯并咪唑结构式分别如式(II)和式(III)所示，本专利技术研究表明可利用5
‑
氨基苯并咪唑和/或5
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羧基苯并咪唑作为半抗原制备甲醛的人工抗原和/或甲醛抗体，并间接检测甲醛；
[0027][0028]第三方面，一种甲醛人工抗原，为人工抗原1或人工抗原2，人工抗原1结构式如式(IV)所示，
[0029][0030]人工抗原2结构式如式(V)所示，
[0031][0032]优选地，所述甲醛人工抗原偶联的载体蛋白(protein)为乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
[0033]所述甲醛人工抗原在制备甲醛抗体中的应用也在本专利技术的保护范围之内。
[0034]第四方面，所述人工抗原1的制备方法，以5
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氨基苯并咪唑为半抗原，通过重氮化法偶联载体蛋白。
[0035]作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
[0036]先将半抗原5
‑
氨基苯并三唑溶解于冰盐酸中，然后加入NaNO2溶液冰浴避光搅拌反应，反应结束后将反应液在冰浴搅拌下缓慢加入载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；偶联混合物在低温下透析数天，得到所述人工抗原1。
[0037]优选地，所述人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
[0038](1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS缓冲液中；
[0039](2)将5
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氨基苯并咪唑半抗原溶解于1M冰盐酸溶液中；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为30～300：1；
[0040](3)将NaNO2加入到步骤(2)的半抗原溶解液中，4℃避光反应形成重氮盐；所述NaNO2与半抗原的摩尔比为1～2：1。
[0041](4)将重氮盐滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，4℃避光偶联2h；反应完成后，将偶联混合物于4℃下，用PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原1。
[0042]进一步优选地，所述半抗原与乳铁蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测甲醛的免疫分析方法，其特征在于，以甲醛人工抗原为包被原和免疫原，以免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测；其中，所述甲醛人工抗原为结构式如式IV所示的人工抗原1或结构式如式V所示的人工抗原2；式IV如下：式V如下：2.一种甲醛人工抗原，其特征在于，为人工抗原1或人工抗原2，其中，人工抗原1结构式如式(IV)所示，人工抗原2，结构式如式(V)所示，
3.权利要求2所述甲醛人工抗原在制备甲醛抗体中的应用。4.一种甲醛人工抗原组合，其特征在于，包括权利要求2所述人工抗原中的两种。5.权利要求4所述甲醛人工抗原组合在制备甲醛抗体和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗林，梁蕊，徐振林，周凯，贾宝珠，孙远明，雷红涛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：