一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因以及抗冻石斑鱼的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因以及抗冻石斑鱼的构建方法。所述的用于石斑鱼的抗冻蛋白基因，其结构从左到右分别为：元件左右臂、增强子、启动子、抗冻肽、kozak、IRES、EGFP和3

【技术实现步骤摘要】
一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因以及抗冻石斑鱼的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因以及抗冻石斑鱼的构建方法。

技术介绍

[0002]石斑鱼属于热带品种，需要高水温才能生长，因此限制了其生产范围，但是现在全国人民都喜爱吃鲜活海鲜，尤其石斑鱼更是商务宴请、婚庆、节假日酒席必点海鲜之一，但是高额的价钱限制其日常更高频的消费，因此降低成本才能让更多百姓更经常的消费石斑鱼。
[0003]石斑鱼成本高主要是生产区域有限，物流成本高，因此就近养殖是降低成本途径之一，同时就近养殖往往自然水温不够，需要对水体进行加热，因此需要降低能耗开销。传统养殖石斑鱼，尤其是东星斑，采用流水养殖，冬天需要加温，能耗极大，原来采用烧煤方式，目前因为环保，烧煤不允许了，需要采用电加热或者天然气加热，能耗非常高。
[0004]因此，构建一种能够抗冻的石斑鱼，对于降低石斑鱼的养殖成本以及扩大养殖范围具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本专利技术提供了一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因。
[0006]本专利技术第二方面还提供了一种抗冻石斑鱼的构建方法。
[0007]本专利技术所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
[0008]一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因，其结构从左到右分别为：元件左右臂、增强子、启动子、抗冻肽、kozak、IRES、EGFP和3
’
末端片段。
[0009]专利技术人在大量的实验中惊奇的发现，采用上述用于石斑鱼的抗冻蛋白基因改造石斑鱼，可以显著的提高石斑鱼的抗冻能力；采用上述用于石斑鱼的抗冻蛋白基因改造的石斑鱼，其无需对水温进行加热即可进行养殖；尤其是在冬季低温下，无需对水温加热也同样能够实现养殖。因此，采用的上述用于石斑鱼的抗冻蛋白基因改造的石斑鱼，其可以大幅的降低养殖成本以及可以扩大石斑鱼的养殖范围。
[0010]本专利技术还提供了一种抗冻石斑鱼的构建方法，将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因插入到石斑鱼的基因中，进而构建出抗冻石斑鱼。
[0011]具体地，所述的抗冻石斑鱼的构建方法，包含如下步骤：
[0012](1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体：将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因连接在载体上，构建石斑鱼靶向转基因表达载体；
[0013](2)雄性转基因石斑鱼的制备：将石斑鱼靶向转基因表达载体注射至雄性石斑鱼的精巢内，利用精子携带法制备得到雄性转基因石斑鱼；
[0014](3)转基因石斑鱼的培育：待雄性转基因石斑鱼性细胞发育成熟后，取雄性转基因
石斑鱼的精子与雌性石斑鱼的卵子混合进行人工授精得受精卵；将受精卵进行孵化培育得抗冻石斑鱼。
[0015]专利技术人通过该大量的实验研究表明，通过本专利技术所述的构建方法，可以有效的提高抗冻石斑鱼的转基因效率。
[0016]优选地，步骤(1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体的具体步骤为：将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因与元件左右臂、增强子、启动子、kozak、IRES、EGFP和/或3
’
末端片段连接在载体上，构建石斑鱼靶向转基因表达载体。
[0017]优选地，步骤(1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体的步骤中，所述的载体为p19T
‑
Simple。
[0018]优选地，步骤(2)中将转基因片段溶于无菌生理盐水中注射至雄性石斑鱼的精巢内；
[0019]其中，无菌生理盐水中转基因片段的浓度为0.5～1.5ug/mL。
[0020]最优选地，无菌生理盐水中转基因片段的浓度为1.0ug/mL。
[0021]优选地，步骤(3)中，还包括对雄性转基因石斑鱼进行人工促熟步骤；
[0022]所述的人工促熟是指采用投饵或注射DOM或HCG的方法进行人工促熟。
[0023]优选地，所述的石斑鱼为东星斑。
[0024]本专利技术还提供了一种上述用于石斑鱼的抗冻蛋白基因在构建抗冻石斑鱼中的应用。
[0025]有益效果：本专利技术首先提供了一种全新的用于石斑鱼的抗冻蛋白基因；采用本专利技术所述的用于石斑鱼的抗冻蛋白基因改造石斑鱼，可以显著的提高石斑鱼的抗冻能力；其可以大幅的降低养殖成本以及可以扩大石斑鱼的养殖范围。
具体实施方式
[0026]以下结合具体实施例来进一步解释本专利技术，但实施例对本专利技术不做任何形式的限定。
[0027]实施例1抗冻石斑鱼的构建方法
[0028](1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体：将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因与元件左右臂、增强子、启动子、kozak、IRES、EGFP和/或3
’
末端片段连接在p19T
‑
Simple上，构建石斑鱼靶向转基因表达载体Va；
[0029]Va(p19T
‑
S
‑
L
‑
En
‑
ActinP
‑
IRES
‑
EGFP
‑
R)的具体构建方法为：
[0030]1.诱导型启动子获得：
[0031](1)SSH文库的构建
[0032]为了获得细菌诱导型基因启动子，本研究应用抑制性消减杂交技术来获得杂色鲍细菌诱导型基因。
[0033]1)东星斑致病菌的分离及分子鉴定
[0034]用TCBS法从病鲍体内的肠道分离出三株菌，分别命名为A、B和C，用细菌通用引物(27F/1492R)对这三株菌进行分子鉴定。获得的PCR产物进行克隆测序，然后在NCBI数据库中进行比对搜索。
[0035]2)东星斑致病菌的回归感染
[0036]根据当时分离时菌落的数量，然后模拟这种菌落结构进行系列回归感染实验，探索出它们的数量与致病效果的关系即找到半致死量。
[0037]3)东星斑的攻毒
[0038]根据摸索的半致死量浓度，对暂养了一周的25cm规格的雌性东星斑进行攻毒实验，注射处理组60只，注射生理盐水组25只，健康组25只。注射后12h约有一半细菌注射组死亡时开始对活的东星斑进行RNA的提取。
[0039]4)东星斑血细胞RNA的提取及SSH文库的构建
[0040]提取总RNA量为100
‑
200μg，文库的构建参阅任洪林(2008)。
[0041]2)挑选阳性克隆测序及分析
[0042]随机挑选50个阳性克隆进行测序，并对测序结果进行分析，找到可能与免疫相关基因。
[0043]3)Qm基因的发现与mRNA的获取
[0044]1)Qm基因的发现
[0045]根据测序结果，分析发现Qm基因可能与免疫基因有很大相关性。
[0046]2)Qm基因的验证
[0047]对Qm基因在三个不同的处理组进行验证，通过实时定量PCR的方法，以确证Qm为免疫诱导基因。方法可参考2.1.5和文献任洪林(2008)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于石斑鱼的抗冻蛋白基因，其特征在于，所述的用于石斑鱼的抗冻蛋白基因，其结构从左到右分别为：元件左右臂、增强子、启动子、抗冻肽、kozak、IRES、EGFP和3
’
末端片段。2.一种抗冻石斑鱼的构建方法，其特征在于，将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因插入到石斑鱼的基因中，进而构建出抗冻石斑鱼。3.根据权利要求1所述的抗冻石斑鱼的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：(1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体：将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因连接在载体上，构建石斑鱼靶向转基因表达载体；(2)雄性转基因石斑鱼的制备：将石斑鱼靶向转基因表达载体注射至雄性石斑鱼的精巢内，利用精子携带法制备得到雄性转基因石斑鱼；(3)转基因石斑鱼的培育：待雄性转基因石斑鱼性细胞发育成熟后，取雄性转基因石斑鱼的精子与雌性石斑鱼的卵子混合进行人工授精得受精卵；将受精卵进行孵化培育得抗冻石斑鱼。4.根据权利要求3所述的抗冻石斑鱼的构建方法，其特征在于，步骤(1)构建石斑鱼靶向转基因表达载体的具体步骤为：将用于石斑鱼的抗冻蛋白基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦骥，
申请(专利权)人：深圳精渔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：