不结球白菜的分子标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种不结球白菜的分子标记引物及其应用。本发明专利技术公开了一种不结球白菜紫叶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了检测上述不结球白菜紫叶基因的分子标记引物。所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。本发明专利技术还公开不结球白菜的分子标记引物在鉴定不结球白菜紫叶品种中的应用。本发明专利技术的不结球白菜的分子标记引物，可用于高效鉴定不结球白菜紫叶品种，在幼苗期即可完成鉴定，实现苗期叶色选择。操作简单，鉴定成本低，效率高，可加快不结球白菜的育种进程。程。程。

【技术实现步骤摘要】
不结球白菜的分子标记引物及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及不结球白菜的分子标记引物及其应用。

技术介绍

[0002]不结球白菜(Brassica campestris.ssp.chinensis.Makino)在我国蔬菜消费中占有重要地位，其富含对人体有利的维生素C、蛋白质、矿物质、粗纤维等营养物质，其中又以紫色不结球白菜的花青苷含量尤为丰富，观赏性也更高。花青苷是糖基化的多酚类化合物，易溶于水，是蔬菜和水果重要的呈色物质。花青苷能够保护植物抵抗各种生物和非生物胁迫，在人体中还具有抗氧化、抗癌，降低血压和血脂，减缓阿尔兹海默症等功效。因此，设计一种可以快速鉴定紫叶不结球白菜分子标记引物，大大缩短育种进程，进而培育出营养价值更高且观赏性极佳的不结球白菜，对产量和品质具有重要意义。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供了一种不结球白菜紫叶基因；本专利技术的第二目的是提供一种高效检测紫叶不结球白菜的分子标记引物及其应用；本专利技术的第三目的是提供一种鉴定不结球白菜紫叶品种的方法。
[0004]技术方案：本专利技术所述的不结球白菜紫叶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]本专利技术所述的检测上述不结球白菜紫叶基因的分子标记引物。
[0006]进一步地，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。
[0007]本专利技术所述的分子标记引物在鉴定不结球白菜紫叶品种中的应用。
>[0008]本专利技术所述的一种鉴定不结球白菜紫叶品种的方法，包括以下步骤：
[0009](1)提取待鉴定样品的基因组DNA；
[0010](2)将步骤(1)得到的基因组DNA作为模板，利用所述的分子标记引物进行PCR扩增；
[0011](3)对步骤(2)得到的扩增产物进行聚丙烯酰胺电泳分离，如果分离的产物中含有150bp的片段，则说明待鉴定样品不结球白菜的叶片为紫色。
[0012]进一步地，步骤(2)中所用的扩增体系为：DNA模板、Pur54引物、2
×
Primer Star、去离子水。
[0013]进一步地，步骤(2)中所用的扩增体系为：50ng/μL DNA模板1μL、10μM Pur54引物各0.5μL、2
×
Primer Star 5μL、去离子水3μL，总反应体系为10μL。
[0014]进一步地，步骤(2)中所用的扩增程序为：95℃预变性2min，98℃变性30s，59.8℃退火30s，72℃延伸30s，72℃后延伸10min，35个循环，冷却至4℃保存。
[0015]本专利技术所述的紫叶不结球白菜的选育方法，所述的紫叶不结球白菜含有上述的不结球白菜紫叶基因
[0016]进一步地，在育种过程中采用上述的分子标记引物选择不结球白菜颜色的性状。
[0017]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本专利技术的不结球白菜的分子标记引物，可用于高效鉴定不结球白菜紫叶品种，在幼苗期即可完成鉴定，实现苗期叶色选择。操作简单，鉴定成本低，效率高，可加快不结球白菜的育种进程。
附图说明
[0018]图1为使用本专利技术引物对不同品种的不结球白菜进行PCR扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果图(其中，M为DL500 Marker)。
具体实施方式
[0019]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0020]实施例1
[0021]本实施提供的一种鉴定不结球白菜紫叶性状的方法，包括以下步骤：
[0022]步骤1，不结球白菜基因组DNA的提取
[0023]根据植物基因组DNA快速提取试剂盒(购自于北京天根生化科技有限公司，DP105)说明书提取DNA，简要如下：
[0024]1)取植物新鲜组织约100mg，加入液氮充分碾磨；
[0025]2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL已在65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min；
[0026]3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；
[0027]4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；
[0028]5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
[0029]6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0030]7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0031]8)重复操作步骤7；
[0032]9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0033]10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
[0034]11)DNA经纯度及浓度检测，稀释到50ng/μL，存放于
‑
20℃冰箱中备用。
[0035]步骤2，标记引物Pur54在不结球白菜基因组中扩增
[0036]在10μL反应体系中，50ng/μL DNA模板1μL、10μM标记引物Pur54各0.5μL、2
×
Primer Star 5μL、去离子水3μL。
[0037]Pur54标记引物(委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成)：
[0038]Pur54F(SEQ ID NO.2)：5
’‑
TCCTTATCCGCCACTTCCGC
‑3’
，
[0039]Pur54R(SEQ ID NO.3)：5
’‑
AGCCGGAATAGGCAGTGGAG
‑3’
。
[0040]PCR扩增程序为：95℃预变性2min，98℃变性30s，59.8℃退火30s，72℃延伸30s，72℃后延伸10min，35个循环，4℃保存。
[0041]步骤3，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0042]PCR扩增结束后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE胶电泳)，电泳缓冲液为1
×
TBE，1μL上样，150V电泳56min后，染色、观察并拍照。
[0043]为了验证本方法的可行性，使用本方法分别鉴定38个不结球白菜样本，所有样本均来自南京农业大学白菜系统生物学实验室。
[0044]电泳结果如图1可知，在泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不结球白菜紫叶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种检测权利要求1所述的不结球白菜紫叶基因的分子标记引物。3.根据权利要求2所述的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。4.一种权利要求3所述的分子标记引物在鉴定不结球白菜紫叶品种中的应用。5.一种鉴定不结球白菜紫叶品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待鉴定样品的基因组DNA；(2)将步骤(1)得到的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的分子标记引物进行PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行聚丙烯酰胺电泳分离，如果分离的产物中含有150bp的片段，则说明待鉴定样品不结球白菜的叶片为紫色。6.根据权利要求5所述的鉴定不结球白菜紫叶品种的方法，其特征在于，步骤(2)中所用的扩增体系为：DNA模板、分子标记引物、2
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤伟华，刘叶琼，潘颀，孙朋朋，全张妮，叶彬彬，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：