一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W545及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W545及其制备方法与应用。本发明专利技术通过基因工程技术将Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位基因，以及Rv1419、Rv3407和Rv2628c的表位基因串联融合在一起，并连接到真核表达载体pVAX1上，构建得到一种多抗原免疫优势表位的新型结核杆菌DNA疫苗W545。本发明专利技术所制备的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W545，可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核模型可使其脏器组织病变范围显著减少，病变减轻，可用于制备预防或治疗结核病的药物或疫苗中。疫苗中。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W545及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W545及其制备方法与应用，具体涉及一种应用基因工程技术制备的新型结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W545及其应用，属于结核病医学免疫学预防和治疗


技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis，TB)一直是人们关注的一个全球性健康问题。世界卫生组织(WHO)2020年全球结核病报告指出，在2019年，全球有1000万结核病新发病例，120万死亡病例。全世界大概有1/3的人存在结核分枝杆菌(M.tb)潜伏感染，其中5％～10％的感染者最终会发展为TB患者。我国的结核病人数位居世界第三。我国约有三分之一人口感染了结核菌，其中5％可能早期发病，5％在其一生中的任何时候可能发病，而且耐药结核病人多。因此，结核感染人群的预防治疗可有效减少肺结核的发病率，结核病患者的早期诊断、有效化疗将控制结核病及结核菌的传播。对处于不同阶段的M.tb感染进行有效防治至关重要。
[0003]结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性呼吸道传染病，合理、规律的化疗一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗3～4个月，甚至更长时间。由于耐药菌株的传播，耐药结核病(尤其是耐多药结核病和广泛耐药结核病)的治疗是我国未来结核病控制重点关注的问题。目前在临床使用的十几种抗结核药物已数十年，初治结核病化疗方案通常需3<br/>‑
4个药物治疗6个月以上，而复治或耐药结核病通常需5
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6种药物治疗1年以上，再加上药物的毒副作用，二线药物价格昂贵，部分病人难以坚持。由于研制新的抗结核药物，不仅投入大，周期长，比新的治疗性疫苗的研制更困难，而且新药也可能很快产生耐药性。而疫苗治疗在几个月中只注射几针，远比每天服药方便，且副作用较少，费用低。抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，疫苗治疗可以通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的潜力，来达到治疗疾病的目的。因此，近年来通过免疫调节治疗结核病成为研究的热点之一，治疗性疫苗的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。
[0004]疫苗接种是预防结核病最有效的途径。目前国内外结核病疫苗研究的种类主要有下列三种：活疫苗、亚单位疫苗和灭活疫苗。亚单位疫苗只用结核分枝杆菌的一部分成份引起机体产生免疫保护反应，主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗或多肽疫苗(加佐剂)、多肽以外的其它纯化的主要成份(如枝菌酸、糖脂等)，它可作为卡介苗的加强疫苗，也可作为治疗性疫苗。与其它类型的疫苗相比，核酸疫苗具有以下优点：DNA疫苗可诱导全面的免疫应答：既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫，尤其是可诱导产生CTL应答，其能够识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体，这对于杀死寄生于巨噬细胞内的结核分枝杆菌是有效清除途径，这可弥补卡介苗诱导CTL应答弱的不足，是结核重组蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗所不能比拟的；(2)可克服蛋白亚单位疫苗易发生错误折叠和糖基化不完全的问题；(3)通过表达多种抗原的质粒混合或构建能同时表达多种抗原的复杂的质粒制备多价疫苗，这符合WHO儿童疫苗计划长远目标(用一种疫苗预防多种疾病)的要求；(4)产生持久免
疫应答，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫；(5)接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力反祖或残留毒力病毒颗粒而引发疾病的危险，应用较安全；(6)制备简便，生产成本较低；(7)核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，易于贮存和运输。此外，DNA疫苗制备及应用较简单，不需要任何化学载体，对于免疫低下者比BCG更安全。该疫苗研制的关键在于保护性抗原的选择、剂量的确定，抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，选择抗原作为DNA疫苗的主要标准是它们能否诱导保护性T细胞反应，保护人群抗结核，抗原的筛选和构建至关重要。目前的研究证明结核分枝杆菌多种保护性抗原混合、融合或嵌合的疫苗刺激的CD4
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和CD8
+
T细胞反应及获得的保护效力、治疗效果和长期存活能力均比单一疫苗成分强。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种针对结核分枝杆菌(M.tb)感染做出快速有效的细胞免疫应答、抑制体内结核分枝杆菌的生长、抑制M.tb的内源性复燃，并且用于结核病感染的预防和治疗的结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗及其制备方法与应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种结核分枝杆菌DNA疫苗，并将其命名为W545。
[0007]本专利技术提供的结核分枝杆菌DNA疫苗W545的活性成分是表达融合蛋白的重组真核细胞表达载体；所述融合蛋白包括抗原表位A、抗原表位B、抗原表位C、抗原表位D、抗原表位E、抗原表位F、抗原表位G、抗原表位H、抗原表位I、抗原表位J、抗原表位K和抗原表位L：
[0008]所述抗原表位A的氨基酸序列如序列表中序列1第3
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291位所示；
[0009]所述抗原表位B的氨基酸序列如序列表中序列1第299
‑
313位所示；
[0010]所述抗原表位C的氨基酸序列如序列表中序列1第319
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327位所示；
[0011]所述抗原表位D的氨基酸序列如序列表中序列1第333
‑
368位所示；
[0012]所述抗原表位E的氨基酸序列如序列表中序列1第374
‑
393位所示；
[0013]所述抗原表位F的氨基酸序列如序列表中序列1第399
‑
407位所示；
[0014]所述抗原表位G的氨基酸序列如序列表中序列1第413
‑
426位所示；
[0015]所述抗原表位H的氨基酸序列如序列表中序列1第432
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449位所示；
[0016]所述抗原表位I的氨基酸序列如序列表中序列1第457
‑
580位所示；
[0017]所述抗原表位J的氨基酸序列如序列表中序列1第588
‑
602位所示；
[0018]所述抗原表位K的氨基酸序列如序列表中序列1第608
‑
643位所示；
[0019]所述抗原表位L的氨基酸序列如序列表中序列1第649
‑
668位所示。
[0020]上述DNA疫苗中，抗原表位A为Ag85A蛋白抗原表位。Ag85A蛋白不仅可以刺激机体产生体液免疫，尚可激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8
+
T细胞增殖和IL
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2及IFN
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γ等细胞因子水平的上升。
[0021]抗原表位B、抗原表位C、抗原表位D、抗原表位E、抗原表位F、抗原表位G和抗原表位H均为Ag85B蛋白抗原表位。Ag85B蛋白可诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，产生高浓度IFN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌DNA疫苗，其活性成分是表达融合蛋白的重组真核细胞表达载体；所述融合蛋白包括抗原表位A、抗原表位B、抗原表位C、抗原表位D、抗原表位E、抗原表位F、抗原表位G、抗原表位H、抗原表位I、抗原表位J、抗原表位K和抗原表位L：所述抗原表位A的氨基酸序列如序列表中序列1第3
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291位所示；所述抗原表位B的氨基酸序列如序列表中序列1第299
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313位所示；所述抗原表位C的氨基酸序列如序列表中序列1第319
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327位所示；所述抗原表位D的氨基酸序列如序列表中序列1第333
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368位所示；所述抗原表位E的氨基酸序列如序列表中序列1第374
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393位所示；所述抗原表位F的氨基酸序列如序列表中序列1第399
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407位所示；所述抗原表位G的氨基酸序列如序列表中序列1第413
‑
426位所示；所述抗原表位H的氨基酸序列如序列表中序列1第432
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449位所示；所述抗原表位I的氨基酸序列如序列表中序列1第457
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580位所示；所述抗原表位J的氨基酸序列如序列表中序列1第588
‑
602位所示；所述抗原表位K的氨基酸序列如序列表中序列1第608
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643位所示；所述抗原表位L的氨基酸序列如序列表中序列1第649
‑
668位所示。2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：编码所述抗原表位A的核酸分子如序列表中序列2第7
‑
873位所示；编码所述抗原表位B的核酸分子如序列表中序列2第895
‑
939位所示；编码所述抗原表位C的核酸分子如序列表中序列2第955
‑
981位所示；编码所述抗原表位D的核酸分子如序列表中序列2第997
‑
1104位所示；编码所述抗原表位E的核酸分子如序列表中序列2第1120
‑
1179位所示；编码所述抗原表位F的核酸分子如序列表中序列2第1195
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1221位所示；编码所述抗原表位G的核酸分子如序列表中序列2第1237
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1278位所示；编码所述抗原表位H的核酸分子如序列表中序列2第1294
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1347位所示；编码所述抗原表位I的核酸分子如序列表中序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁艳，吴雪琼，赵卫国，贾再兴，阳幼荣，龚文平，薛勇，张俊仙，王小鸥，王兰，王杰，刘银萍，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第八医学中心，
类型：发明
国别省市：