一种测定谷氨酰胺合成酶酶活的方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetaes,GS)酶活检测技术，具体的说是检测动物细胞表达的GS蛋白合成谷氨酰胺(Glutamine，Gln)的能力。本发明专利技术以293T为工具细胞，获得含GS的粗提酶混合液，通过实验组

【技术实现步骤摘要】
一种测定谷氨酰胺合成酶酶活的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学，细胞生物学领域。涉及温和细胞蛋白提取方法，适用于后续测定蛋白酶活。

技术介绍

[0002]细胞谷氨酰胺(Glutamine，Gln)合成酶Glutamine sysnthetase(GS)是动植物氮代谢的核心，也是哺乳动物细胞中唯一可以直接利用NH
4+
合成谷氨酰胺的蛋白。谷氨酰胺在肿瘤代谢中发挥了重要作用，包括肝癌，乳腺癌，胰腺癌，胶质瘤中都存在glutamine addicted。在偏好谷氨酰胺的细胞中，高度依赖GS酶活。
[0003]此外，在《新英格兰杂志》的一篇文章中报道了在两例严重脑畸形导致多器官衰竭和死亡的新生儿中，GS的R341C、R324C突变引发的谷氨酰胺酶活几乎丧失。研究表明GS
‑
KO小鼠也在出生后第三天死亡。可见GS酶活在生命体生长中发挥着不可替代的作用，GS突变造成的GS酶活deficiency的研究也具有了重要意义。
[0004]GS利用谷氨酸和NH
4+
，消耗ATP的情况下生成谷氨酰胺，同时，GS还具有谷氨酰胺转移酶能力，催化谷氨酰胺和羟胺产生γ
‑
谷氨酰胺羟肟酸。γ
‑‑
谷氨酰胺转移反应可用于测定谷氨酰胺合成酶活性。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题为如何简单且准备的测定GS不同突变体的酶活差异。
[0006]本专利技术提供一种简便经济的GS酶活检测技术，包括以下步骤：
[0007]①
在293T细胞中转染不同的GS(NCBI序列号为NM_001033044.4)突变表达质粒2μg(转染步骤参照proteintech官网)；
②
转染36
‑
48h后收集293T细胞与1.5ml EP管中。
③
按照1
×
106个细胞150μl比例加入50mM,PH 6.8咪唑(麦克林，I823673),吹打混匀后放置于
‑
80
°
，30分钟；
④
取出后室温放置15分钟，待其融化后，12000rpm,离心10分钟；
⑤
取50μl上清于新的EP管中，加入0.5倍体积的2
×
SDS loading buffer(酷来搏)，作为western样品；另取100μl上清于新的EP管中，每个离心管加入等体积反应液1(50mM imidazole(咪唑),20mM Na2HPO4 0.16mM ADP,50mM Gln,25mM hydroxylamine(羟氨),2mM MnCl2)中，37
°
水浴45分钟。
⑥
取出，加入200μl反应液2(2.42％ferric chloride(三氯化铁),1.45％TCA(三氯乙酸),and 1.82％HCl)；混匀。12000rpm,离心5分钟；
⑦
取上清于96孔板中，分光光度计检测波长540nm的吸光值。
⑧
将上述得到的蛋白样品进行免疫印迹试验，得到GS突变体的相对表达丰度后计算最终的相对GS酶活。
[0008]本专利技术关键操作内容注意事项包括：
[0009](1)GS突变表达质粒表达的GS蛋白丰度不能太低，太低GS酶活差异不明显；如果是检测的细胞系的酶活差异，根据GS的表达情况，所需要的细胞数要相应增加；
[0010](2)在试验中需要设置对照组，每个样品都需要设置对照组，对照组们的反应液1中Gln用ddH20替代；
[0011](3)为保证数据的可靠性，需要设置至少3个重复组；
[0012](4)所用的反应液1和反应液2现用现配。
[0013]本专利技术以细胞为材料，经过在提取的粗酶溶液中加入反应液(50mM imidazole,20mM Na2HPO4 0.16mM ADP,50mM Gln,25mM hydroxylamine,2mM MnCl2)和终止液(2.42％ferric chloride(三氯化铁),1.45％TCA(三氯乙酸),and 1.82％HCl)，最终测量得到样品在540nm出的吸光值。本试剂盒操作简单，尤其适用对比GS不同突变体的酶活检测。
附图说明
[0014]图1 293T细胞过表达不同量GS的酶活变化情况与对应的蛋白表达情况；
[0015]图2 293T细胞过表达GS野生型与突变体R341C(GS 341位的精氨酸突变为半胱氨酸，是已知的谷氨酰胺合成酶酶活缺陷)的酶活与对应的免疫印迹图片。
具体实施方式
[0016]本专利技术公开了一种GS酶活检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进技术参数实现，技术参数包括工具细胞的选择，粗酶提取液的蛋白浓度，
‑
80
°
放置时间。以上技术参数的改动对结果的影响不大，都被视为包括在本专利技术。本专利技术方法及应用已经通过实例进行详细描述，相关人员能够轻松的对本文所述方法进行应用。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：试剂易获取，方法简易、易行，能快速、高质量的检测GS的酶活。
[0017]实施例1
[0018]GS
‑
野生型(NCBI序列号为NM_001033044.4)的酶活检测
[0019]在5个6厘米细胞培养皿中分别铺5
×
105个细胞，24h后利用PEI转染试剂(Proteintech，#PR40001)转染293T细胞(上海细胞库)GS表达质粒(PcDNA3.0)：每个培养皿中的加入量分别为1、1.5、2、2.5、3微克(质粒构建方法参照[1]Liu,X.,Chen,D.,Chen,H.,Wang,W.,Liu,Y.,Wang,Y.,Duan,C.,Ning,Z.,Guo,X.,Otkur,W.,Liu,J.,Qi,H.,Liu,X.,Lin,A.,Xia,T.,Liu,H.X.&Piao,H.L.(2021)YB1 regulates miR
‑
205/200b
‑
ZEB1axis by inhibiting microRNA maturation in hepatocellular carcinoma.41,576
‑
595.)。48h后用1
×
PBS缓冲液(麦克林)冲洗并收取细胞于1.5ml EP管中，1200rpm,室温离心5分钟，吸去上清，每管加入150μl 50mM咪唑缓冲液，涡旋混匀后放入
‑
80
°
冰箱，30分钟后取出，室温放置15分钟后10000rpm,离心15分钟,离心得到的上清液为粗酶提取物，取出40μl作为免疫印迹的样品于EP管中，每管(5个转染组对应5个EO管)加入等体积的2
×
SDS loading buffer。剩下的粗酶提取液取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定谷氨酰胺合成酶酶活的方法，其特征在于：1)收集转染GS(谷氨酰胺合成酶)36
‑
48小时的细胞于EP管中，离心后去上清；按照细胞数量(1*105‑
1*106个)加入100
‑
200μl 45
‑
50mM咪唑缓冲液(PH 6.8
‑
7.0)；2)将细胞吹散后，放置于
‑
70至
‑
80
°
，30
‑
40分钟；取出，室温放置15
‑
20分钟，10000
‑
120000rpm,10
‑
25分钟；上清即为粗酶溶液；3)从上述步骤中取出30
‑
50μl粗酶溶液后的剩余的粗酶溶液中，等分两份：一个实验组加入到等体积的反应液1(50mM imidazole,20mM Na2HPO4 0.16mM ADP,50mM Gln(谷氨酰胺),25mM hydroxylamine,2mMMnCl2)中、另一个对照组加入到等体积的反应液1(反应液1中不...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴海龙，凌婷，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：