利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达硫酸软骨素修饰酶的方法及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达硫酸软骨素修饰酶的方法及应用。本发明专利技术构建了ODV

【技术实现步骤摘要】
利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达硫酸软骨素修饰酶的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达硫酸软骨素修饰酶的方法及应用。

技术介绍

[0002]硫酸软骨素是一种广泛存在于动物软骨组织、结缔组织中的多糖，由D
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葡萄糖醛酸和N
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乙酰
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D
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半乳糖胺以β
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1，3糖苷键连接而成的二糖单元再通过β
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1，4糖苷键聚合而成。硫酸软骨素糖单元上可能存在多种修饰，例如D
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葡萄糖醛酸可被差向异构化修饰形成艾杜糖醛酸；N
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乙酰
‑
D
‑
半乳糖胺的C
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4位和C
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6位羟基可被硫酸酯化修饰。根据糖单元上修饰种类和位置的不同，硫酸软骨素可以分为多个家族。其中，硫酸软骨素A主要由D
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葡萄糖醛酸和C
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4位硫酸酯化的N
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乙酰...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达硫酸软骨素修饰酶的方法，其特征在于，先构建敲除了ODV
‑
e66包膜蛋白编码基因的重组杆状病毒，然后利用同源重组技术将表达硫酸软骨素修饰酶的重组质粒与重组杆状病毒基因组融合后导入昆虫细胞中，培养细胞，并从细胞培养液中收集硫酸软骨素修饰酶；所述硫酸软骨素修饰酶为软骨素4
‑
O
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硫酸转移酶或软骨素N
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乙酰半乳糖胺
‑4‑
硫酸酯
‑6‑
O
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硫酸转移酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODV
‑
e66包膜蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白；所述软骨素4
‑
O
‑
硫酸转移酶是具有将软骨素中N
‑
乙酰半乳糖胺C
‑
4位羟基进行硫酸化修饰功能的酶蛋白；优选地，所述软骨素4
‑
O
‑
硫酸转移酶包含如下的氨基酸序列或由其组成：A)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或B)在A)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或C)A)或B)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的酶蛋白；所述软骨素N
‑
乙酰半乳糖胺
‑4‑
硫酸酯
‑6‑
O
‑
硫酸转移酶是具有将软骨素中4
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硫酸酯N
‑
乙酰半乳糖胺C
‑
6位羟基进行硫酸化修饰功能的酶蛋白；优选地，所述软骨素4
‑
O
‑
硫酸转移酶包含如下的氨基酸序列或由其组成：a)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或b)在a)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或c)a)或b)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的酶蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，昆虫细胞选自Sf9、Sf21、High Five。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达硫酸软骨素修饰酶的重组质粒由强启动子驱动；所述强启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将含有杆状病毒基因组的重组质粒bMON14272导入到E.coli BW25113/pIJ790细胞中，筛选具有卡那霉素和氯霉素双抗性的重组菌株转化子BW25113/pIJ790/Bacmid；利用SEQ ID NO:4
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5所示引物对Ac
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odv
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de66F/Ac
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odv
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de66R扩增pIJ773质粒上的安普霉素抗性基因aac(3)IV，并将PCR扩增产物转化至BW25113/pIJ790/Bacmid感受态细胞中，筛选具有卡那霉素和安普霉素抗性的转化子；利用SEQ ID NO:6

【专利技术属性】
技术研发人员：李金娥，王艳艳，田宇清，李俊乐，谭华荣，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：