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一种生产目标蛋白的重组载体、重组杆状病毒及其构建方法和应用技术

技术编号:37486250 阅读:25 留言:0更新日期:2023-05-07 09:25
本发明专利技术提供了一种生产目标蛋白的重组载体、重组杆状病毒及其构建方法和应用,属于基因工程技术领域。本发明专利技术以pFast

【技术实现步骤摘要】
一种生产目标蛋白的重组载体、重组杆状病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
,具体涉及一种生产目标蛋白的重组载体、重组杆状病毒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]杆状病毒表达系统是四大表达系统之一,其在蛋白表达,森林病虫害防控以及疫苗制备等方面具有广阔的应用前景。家蚕

杆状病毒表达载体系统(BEVS)是生产重组蛋白的有力工具,其生产的真核蛋白具有修饰接近于蛋白的原始形式,并且培养家蚕注射病毒表达外源蛋白成本低,蛋白产量高,是生产目标蛋白的有效手段。但是病毒的感染方式目前依赖注射家蚕方法,费时费力,且成功率低。

技术实现思路

[0003]有鉴于此,本专利技术的目的在于提供一种生产目标蛋白的重组载体、重组杆状病毒及其构建方法和应用,能有效提高目标蛋白的表达量的同时还能避免注射制备可直接口服感染家蚕的病毒。
[0004]本专利技术提供了一种生产目标蛋白的重组载体,以pFast

Dual为骨架载体,还包含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列、目标蛋白基因和纯化标签以及由p10启动子启动表达的编码多角体蛋白基因。
[0005]优选的,所述编码多角体蛋白基因为编码BmCPV polyhedrin蛋白基因;所述编码BmCPV polyhedrin蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0006]优选的,所述编码BmCPV polyhedrin蛋白基因在骨架载体的插入多克隆位点为XhoI/KpnI。
[0007]优选的,所述目标蛋白基因包括编码病毒蛋白的基因;
[0008]所述编码病毒蛋白的基因包括以下一种基因:新冠病毒的S蛋白RBD结构域基因、猪瘟病毒E2蛋白基因、猪圆环病毒的CAP基因;
[0009]所述新冠病毒的S蛋白RBD结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
[0010]所述猪瘟病毒E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
[0011]所述猪圆环病毒的CAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012]本专利技术提供了所述生产目标蛋白的重组载体的构建方法,包括以下步骤:
[0013]将含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列和纯化标签的片段序列和线性载体连接,得到第一重组载体;
[0014]将目标蛋白基因插入所述第一重组载体中,得到第二重组载体;
[0015]将编码多角体蛋白基因插入所述第二重组载体中,得到生产目标蛋白的重组载体。
[0016]优选的,所述编码多角体蛋白基因的扩增引物包括F

p10

cpvpoly/R

p10

cpvpoly引物对;
[0017]所述F

p10

cpvpoly的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示;
[0018]所述R

p10

cpvpoly的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0019]优选的,所述含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列和纯化标签的片段序列是以合成质粒为模板,采用F

PD/R

PD引物对进行PCR扩增得到;
[0020]所述F

PD的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;
[0021]所述R

PD的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
[0022]所述含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列和纯化标签的片段序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
[0023]所述pFast

Dual线性片段是以pFast

Dual为模板,采用F

ZT/R

ZT引物对PCR扩增得到;
[0024]所述F

ZT的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;
[0025]所述R

ZT的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0026]本专利技术提供了一种包裹重组杆状病毒的多角体蛋白,由所述重组载体或所述构建方法得到的重组载体转染昆虫细胞后提取得到。
[0027]本专利技术提供了一种表达目标蛋白的方法,将所述包裹重组杆状病毒的多角体蛋白饲喂家蚕,从感染病毒的家蚕中分离提取得到目标蛋白。
[0028]本专利技术提供了一种生产目标蛋白的家蚕饲料,包括所述包裹有重组杆状病毒的BmCPV的多角体蛋白和基础饲料;
[0029]所述包裹有重组杆状病毒的BmCPV的多角体蛋白和基础饲料的质量比为1~10:1000000。
[0030]本专利技术提供了一种生产目标蛋白的重组载体,以pFast

Dual为骨架载体,还包含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列、目标蛋白基因、编码多角体蛋白基因和纯化标签。本专利技术采用p6.9和pH启动子串联控制表达外源基因,能有效提高外源基因的表达量,同时采用pH启动子启动BmCPVpolyhedrin蛋白基因表达,使构建的重组病毒被多角体蛋白包裹,使重组病毒实现口服感染。可见,本专利技术提供的重组载体为目标蛋白的大量生产提供了有效工具,具有较高的应用价值。
[0031]本专利技术提供的生产目标蛋白的家蚕饲料,包括包裹有重组杆状病毒的BmCPV的多角体蛋白和基础饲料;所述包裹有重组杆状病毒的BmCPV的多角体蛋白是由所述重组载体制备的重组杆状病毒感染昆虫细胞分离得到。所述BmCPV的多角体蛋白包裹重组杆状病毒,通过采食方式完成重组杆状病毒感染家蚕的目的,避免了注射病毒到家蚕中繁琐操作,并且保证了家蚕的高感染率,从而进一步提高目标蛋白的生产效率。
附图说明
[0032]图1为重组载体的结构示意图,其中左图为骨架载体,右图为构建后的重组载体;
[0033]图2为western blot检测3种目标蛋白的表达结果;
[0034]图3为western blot检测RBD蛋白的表达结果;
[0035]图4为ELISA实验检测RBD蛋白的表达结果;
[0036]图5为重组病毒感染细胞形态观察结果;
[0037]图6为重组病毒纯化结果;
[0038]图7为家蚕饲喂添毒感染过程;
[0039]图8为感染家蚕检测RBD蛋白的表达结果。
具体实施方式
[0040]本专利技术提供了一种生产目标蛋白的重组载体,以pFast

Dual为骨架载体,还包含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列、目标蛋白基因和纯化标签以及由p10启动子启动表达的编码多角体蛋白基因。
[0041]在本专利技术中,所本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产目标蛋白的重组载体,其特征在于,以pFast

Dual为骨架载体,还包含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列、目标蛋白基因和纯化标签以及由p10启动子启动表达的编码多角体蛋白基因。2.根据权利要求1所述重组载体,其特征在于,所述编码多角体蛋白基因包括编码BmCPV polyhedrin蛋白基因;所述编码BmCPV polyhedrin蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。3.根据权利要求2所述重组载体,其特征在于,所述编码BmCPV polyhedrin蛋白基因在骨架载体的插入多克隆位点为XhoI/KpnI。4.根据权利要求1所述重组载体,其特征在于,所述目标蛋白基因包括编码病毒蛋白的基因;所述编码病毒蛋白的基因包括以下一种基因:新冠病毒的S蛋白RBD结构域基因、猪瘟病毒E2蛋白基因、猪圆环病毒的CAP基因;所述新冠病毒的S蛋白RBD结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述猪瘟病毒E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;所述猪圆环病毒的CAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。5.权利要求1~4任意一项所述生产目标蛋白的重组载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:将含昆虫杆状病毒p6.9启动子、pH启动子、GP64信号肽序列和纯化标签的片段序列和线性载体连接,得到第一重组载体;将目标蛋白基因插入所述第一重组载体中,得到第二重组载体;将编码多角体蛋白基因插入所述第二重组载体中,得到生产目标蛋白的重组载体。6.根据权利要求5所述构建方法,其特征在于,所述编码多角体蛋白基因的扩增引物包括F

p10

cpvpoly/R

p10

cpvpoly引物对;所述F

p10
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员:韦俊宏范有鹏包佳玲付晓雨李春峰潘国庆周泽扬
申请(专利权)人:西南大学
类型:发明
国别省市:

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