一种用于间充质干细胞的冻存液，包括8v/v％～15v/v％DMSO、85v/v％～92v/v％DMEM基础培养基和营养添加物组成，营养添加物中含有成纤维细胞生长因子、胰岛素、生长激素、转铁蛋白、骨形态发生蛋白4、谷氨酰胺、丙酮酸钠、β
【技术实现步骤摘要】
用于间充质干细胞的冻存液
[0001]本申请是依据申请日为2017年8月7日，申请号为201710668712.4，专利技术创造名称为“无血清冻存液及其在冻存间充质干细胞中的应用”的原申请所提出的分案申请。
[0002]本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种围产期间充质干细胞的无血清冻存液及其冻存方法，通过优化冻存液组分及配方，用生长因子及营养物质替代动物血清，以不含外源性血清、能保持细胞良好活性和生物学特征的方式进行间充质干细胞的冻存。
技术介绍
[0003]间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一类具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞类型，在特定条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞等。人们最早从骨髓中分离得到MSCs，后来发现肝脏、皮肤、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中也有少量MSCs存在。最新研究表明，MSCs具有支持造血、调节免疫功能、促进损伤组织修复和防治移植物抗宿主病等作用，已成为再生医学和组织工程学领域的重要种子细胞与潜在治疗工具。作为MSCs的最早来源，骨髓中MSCs的含量非常少(约占有核细胞总数的0.001％～0.01％)，在衰老和疾病状况下其数量和分化潜能还会下降，无法保证种子细胞质量的稳定性，且骨髓采集为创伤性过程，获取代价较大。相比之下，围产间充质干细胞(PerinatalMesenchymal StemCells，P
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MSCs)为MSCs的科学研究和临床应用提供了新的重要来源。
[0004]P
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MSCs是指以出生相关组织为来源的间充质干细胞，主要为脐血、脐带和胎盘源间充质干细胞，它不仅具有MSCs的共有特性，如多向分化潜能、低免疫原性、旁分泌作用等，相比于脊髓和其他组织来源，还具有如下优势：首先，其细胞含量丰富，制备方法简单；其次，获取过程为非侵袭性操作，对供者无伤害，同时细菌和病毒感染风险较成体组织来源的间充质干细胞低；再者，由于脐血、脐带、胎盘原本为生物废弃物，作为间充质干细胞来源系变废为宝且不会引起道德伦理问题，尤其适用于开展产业化操作。
[0005]1999年～2017年期间，全球注册的干细胞临床研究的6000个项目中，MSCs研究项目占比为4/5。截至2016年12月，我国卫计委备案的13个干细胞临床研究项目中，7项为MSCs研究，其中又有6项为P
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MSCs研究，包括其对狼疮性肾炎、小儿脑性瘫痪、脊髓损伤、急性心梗、心衰等重大疾病的防治作用研究，提示间充质干细胞已经成为继胚胎干细胞、造血干细胞后的又一大研究热点，有着巨大的临床价值和广阔的应用前景。因此，为保障中下游MSCs临床研究的有效开展，安全推进其临床应用，MSCs种子细胞的安全性与质量变得尤为重要。
[0006]细胞冻存是保存细胞的重要手段，可以使细胞在一定时期内脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候进行复苏用于实验研究或临床应用。因此，细胞冻存技术，尤其是冻存液，对于维持冻存细胞活性，降低细胞损伤至关重要。但现有的MSCs冻存液及方法尚有诸多缺点，例如：含有高比例的胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)，可能增加临床研究与应用中外源性蛋白引起排异反应的风险；另无血清冻存方法，因采用血清替代物，
试剂价格昂贵，应用范围受限。如：中国专利技术专利申请201610936192.6公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液，由RPMI
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1640培养基、FBS(2％～5％，v/v)、环丁砜、乙醇、乙二醇、丙二醇、吐温、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉、海藻糖、青霉素，以及冷冻保护剂羟乙基淀粉或葡聚糖组成。中国专利技术专利申请CN201510718538.0公开了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存液与冻存方法，其冻存液由DMSO、基础培养基和FBS(10％～50％，v/v)组成。这些方法的间充质干细胞冻存液中均含有FBS，引入了外源性动物血清。
技术实现思路
[0007]本专利技术的一个目的在于提供一种冻存液，该冻存液不含动物血清，组成成分明确且易于获取，不影响冻存期间细胞的干性和活性，并能避免潜在的冻存液中动物血清造成的临床应用风险。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一种冻存液的制备方法。
[0009]本专利技术的再一个目的在于提供一种冻存液在间充质干细胞冻存中的应用，如：脐带源、胎盘源和脐血源的间充质干细胞等。
[0010]本专利技术的再一个目的在于提供一种冻存液在围产间充质干细胞冻存中的应用。所述无血清冻存液的冻存方法。
[0011]本专利技术提供的一种冻存液，不含血清，包括DMSO8v/v％～15v/v％，DMEM基础培养基85v/v％～92v/v％和营养添加物。
[0012]本专利技术提供的冻存液，还含有：成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowth Factor，bFGF)4.5ng/mL～27ng/mL，胰岛素4.5μg/mL～18μg/mL，生长激素2.7ng/mL～3.5ng/mL，转铁蛋白(Transferrin，TF)0.045μg/mL～0.18μg/mL，骨形态发生蛋白4(BoneMorphogeneticProtein
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4，BMP
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4)0.09ng/mL～0.12ng/mL，谷氨酰胺150mg/L～400mg/L，丙酮酸钠45mg/L～70mg/L，β
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巯基乙醇23μM～60μM，人表皮细胞生长因子(HumanEpidermalGrowthFactor，hEGF)10ng/L～20ng/mL，亚硒酸钠15μM～45μM，人血小板生长因子(PlateletGrowthFactor，PGF)4.5ng/mL～18ng/mL。这些组分单独或组合应用于本专利技术。
[0013]本专利技术提供的冻存液，还含有：维生素B120.18mg/L～0.9mg/L，维生素C0.1mg/L～0.25mg/L，维生素B610μg/L～90μg/L，维生素B20.2mg/L～0.6mg/L，谷氨酸9.6mg/L～16.8mg/L，丙氨酸9.2mg/L～21.3mg/L，甘氨酸5.06mg/L～7.2mg/L，天门冬氨酸8.6mg/L～14.7mg/L，脯氨酸6.9mg/L～13.2mg/L和丝氨酸6.0mg/L～9.8mg/L。这些组分单独或组合应用于本专利技术。
[0014]冻存液中，DMSO的浓度优先选择9v/v％～12v/v％，如：但不仅限于9v/v％、10v/v％、11v/v％和12v/v％。
[0015]冻存液中，优先选择低糖DMEM基础培养基(L
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DMEM)，浓度为88v/v％～91v/v％，如：但不仅限于88v/v％、89v/v％、90v/v％和91v/v％。
[0016]冻存液中，优先选择pH7.0～8.5。
[0017]本专利技术提供的一种冻存液，包括10v/v％DMSO，90v/v％DMEM基础培养基。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于间充质干细胞的冻存液，其特征在于每毫升所述冻存液冻存的间充质干细胞密度为0.5～1.0
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107个细胞；所述的冻存液组成为：8v/v％～15v/v％DMSO、85v/v％～92v/v％DMEM，以及4.5ng/mL～27ng/mL成纤维细胞生长因子，4.5μg/mL～18μg/mL胰岛素，2.7ng/mL～3.5ng/mL生长激素，0.045μg/mL～0.18μg/mL转铁蛋白，0.09ng/mL～0.12ng/mL骨形态发生蛋白4，150mg/L～400mg/L谷氨酰胺，45mg/L～70mg/L丙酮酸钠，23μM～60μMβ
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巯基乙醇，10ng/mL～20ng/mL人表皮细胞生长因子，15μM～45μM亚硒酸钠，4.5ng/mL～18ng/mL人血小板生长因子，9.6mg/L～16.8mg/L谷氨酸、9.2mg/L～21.3mg/L丙氨酸、5.06m...
【专利技术属性】
技术研发人员：章毅，伍婷，陈侃俊，陈亮，李冉，祁成，李萍，王磊，
申请(专利权)人：重庆市干细胞技术有限公司中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司上海市干细胞技术有限公司陕西省干细胞技术有限公司苏州市干细胞技术有限公司三亚市干细胞技术有限公司章毅，
类型：发明
国别省市：
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