一种精子的冷冻保存和复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种精子的冷冻保存和复苏方法，以最大限度的避免冷冻及复苏精子的损伤为切入点，在精子冷冻保存前和冷冻复苏后加入人精浆外泌体，制备了全新的精子冻存液，保护改善了精子在冷冻复苏后的精子功能，孕酮对精子钙信号的激活，降低了对精子的氧化损伤，降低了精子DNA碎片化损伤，显著提升复苏后精子的活力。在冷冻复苏时添加该创新成分还会改善精子的超活化及粘液穿透能力，提高精子的受精能力。本发明专利技术具有成本低廉高效、操作便捷、免疫安全的优点。安全的优点。安全的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种精子的冷冻保存和复苏方法


[0001]本专利技术属于医学
，具体涉及一种精子的冷冻保存和复苏方法。

技术介绍

[0002]精液包括精子和精浆两大部分，精浆的主要作用是保护精子，为精子提供生存所必需的能量和营养物质，也作为输送精子的媒介。外泌体是细胞分泌的一种类似于囊泡的纳米级颗粒，其中蕴含多种机体代谢和生长所必须的重要物质，如蛋白质、脂质、核酸等，通过特殊的转运机制被转运至精子表面以促进精子形态与功能的完善，同时精浆外泌体在提高精子活力、抑制精子提前获能、抗氧化方面也有明显效果。
[0003]从1886年Mouteyazza在
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15℃的条件下冻存精子取得成功，到1949年Polge等用含甘油的稀释液在乙醇干冰中冷冻鸡精液，再到1954年甘油被作为冷冻保护剂、
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79℃的干冰作为冷源而获得世界上第一例冷冻精液人工授精婴儿。临床应用几十年来，冷冻精子技术得到了充足的发展，不断追求高精子复苏存活率成了研究者们一直以来的目标。现有的精子冷冻保护液，通常采用甘油作为冷冻保护剂，但在冻融后精子常因头部前部质膜和顶体外膜破裂空泡化，导致冷冻复苏后的精子受精能力下降，目前已成为冷冻损伤无法规避的问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种精子的冷冻保存和复苏方法，可有效解决使用现有冷冻保护剂引起的诸多不良后果，从而提高冷冻复苏后的精子的受精能力。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种精子的冷冻保存和复苏方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1)人精浆外泌体的分离收集：收集正常可育精液；将精液37℃水浴30min后，以7850g、4℃离心30min，收集上层精浆，将精浆进行过滤；过滤后产物置于超速离心机中以10000g、4℃离心30min去除沉淀，收集上清；再次将收集到的上清在超速离心机中以68000g、4℃离心90min，弃沉淀，收集上清；最后再将上清以10000g、4℃离心90min，去上清，收集沉淀；随后以蔗糖溶液重悬沉淀，100000g、4℃离心90min后得到沉淀，即为精浆外泌体，采用PBS重悬；
[0008]步骤2)精子的冷冻保存：将步骤1)得到的精浆外泌体与待保存的精子样品以1:1的体积比添加到精子冷冻保存液中，置于液氮中进行冷冻保存；
[0009]步骤3)精子的复苏：将液氮中保存的精子复苏活化后，将步骤1)得到的精浆外泌体与复苏后的精子以1:1的体积比添加混合，即可。
[0010]优选地，步骤1)所述过滤如下：将精浆通过0.45μm和0.22μm孔径的微孔滤膜进行过滤。
[0011]优选地，步骤1)所述蔗糖溶液的浓度为0.32M。
[0012]优选地，所述正常可育精液与所述精子样品的来源为同一人。
[0013]本专利技术的有益效果如下：
[0014]本专利技术以最大限度的避免冷冻及复苏精子的损伤为切入点，加入了人精本身的外泌体，制备了全新的精子冻存液，保护改善了精子在冷冻复苏后的精子功能，孕酮对精子钙信号的激活，降低了对精子的氧化损伤，降低了精子DNA碎片化损伤。在冷冻复苏时添加该创新成分还会改善精子的超活化及粘液穿透能力，提高精子的受精能力。本专利技术具有成本低廉高效、操作便捷、免疫安全的优点。
附图说明
[0015]图1为实施例2中在精子冷冻保存前加入人精浆外泌体对精子运动能力的影响：A为总活力，B为前向运动比，C为直线速度，D为平均路径速度，E为曲线速度；
[0016]图2为实施例3中在精子冷冻保存前加入人精浆外泌体孕酮对精子钙信号的激活作用：A为精子对孕酮钙信号响应随时间变化情况，B为精子对孕酮钙信号响应能力；
[0017]图3为实施例4中在精子冷冻保存前加入人精浆外泌体对精子氧化损伤的影响；
[0018]图4为实施例5中在精子冷冻保存前加入人精浆外泌体对精子DNA碎片化损伤的影响；
[0019]图5为实施例6中在精子冷冻复苏后加入人精浆外泌体对精子粘液穿透能力的影响：A为精子爬高1cm能力，B为精子爬高2cm能力。
具体实施方式
[0020]下面结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0021]以下实施例中所采用的试剂如下：
[0022]HS溶液：135mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，2mM CaCl2，20mM HEPES，5mM蔗糖，10mM乳酸，1mM丙酮酸钠，使用NaOH调节pH至7.4。
[0023]HTF溶液：93.8mM NaCl，4.69mM KCl，0.2mM MgSO4，0.37mM KH2PO4，2.04mM CaCl2，21.4mM lactic acid，2.78mM glucose，21mM HEPES，4mM NaHCO3，pH调至7.4，用前加入330mM Na
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Pyruvate(1000:1)，HAS(25:1)，21mM NaHCO3。
[0024]以下实施例中对照组均为在冷冻保护前后不加入人精浆外泌体的样本。
[0025]以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0026]实施例1
[0027]一种精子的冷冻保存和复苏方法，具体步骤如下：
[0028](1)人精浆囊泡(外泌体)的分离收集
[0029]收集正常可育志愿者精液；将精液37℃水浴30min后，以7850g、4℃离心30min，收集上层精浆，将精浆通过0.45μm和0.22μm孔径的微孔滤膜进行过滤；过滤后产物置于超速离心机中以10000g、4℃离心30min去除沉淀，收集上清；再次将收集到的上清在超速离心机中以68000g、4℃离心90min，弃沉淀，收集上清；最后再将上清以10000g、4℃离心90min，去上清，收集沉淀；随后以蔗糖溶液重悬沉淀，100000g、4℃离心90min后得到沉淀，即为精浆囊泡(外泌体)，采用PBS重悬。
[0030](2)精子的冷冻保存
[0031]将收集到的精浆外泌体与精子样品(优选其自身的，即外泌体和精子样品提供者为同一人)以1:1的体积比添加到精子冷冻保存液中，置于液氮中进行冷冻保存。
[0032](3)精子的复苏
[0033]将液氮中保存的精子复苏活化后，将收集到的精浆外泌体与复苏后的精子以1:1的体积比添加混合，即可。
[0034]实施例2
[0035]本实施例检测冷冻前添加外泌体再冷冻复苏对精子的运动能力的影响，具体如下：
[0036]将实施例1中经步骤(2)冷冻保存的精子直接复苏，并设置对照组，用CASA(计算机辅助分析系统)记录motility(总活力)、PR(前向运动)、VCL(曲线速度)、VSL(直线速度)、VAP(平均路径速度)、LIN(侧摆幅度)、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精子的冷冻保存和复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)人精浆外泌体的分离收集：收集正常可育精液；将精液37℃水浴30min后，以7850g、4℃离心30min，收集上层精浆，将精浆进行过滤；过滤后产物置于超速离心机中以10000g、4℃离心30min去除沉淀，收集上清；再次将收集到的上清在超速离心机中以68000g、4℃离心90min，弃沉淀，收集上清；最后再将上清以10000g、4℃离心90min，去上清，收集沉淀；随后以蔗糖溶液重悬沉淀，100000g、4℃离心90min后得到沉淀，即为精浆外泌体，采用PBS重悬；步骤2)精子的冷冻保存：将步骤1)得到的精浆外泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小宁，俞晶焱，黄荣祖，曾旭辉，宋建，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：