分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子VviMYB30及其应用制造技术

本发明专利技术专利申请公开了分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子因VviMYB30及其应用。本申请涉及基因工程领域，尤其是涉及葡萄抗旱育种领域。通过基因克隆技术从不耐旱的欧洲葡萄

【技术实现步骤摘要】
分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子VviMYB30及其应用


[0001]本专利技术属于植物响应逆境基因鉴定及基因工程
，尤其是响应干旱胁迫的葡萄MYB转录因子的分离和鉴定，更具体地涉及从欧洲葡萄
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赤霞珠
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中分离的抗旱负调控MYB转录因子VviMYB30及其在葡萄抗旱中的应用。

技术介绍

[0002]提高葡萄自身抗旱性和水分利用效率，培育抗旱葡萄新种质具有广阔的发展前景。然而，葡萄生长周期长且遗传背景复杂，传统杂交育种对抗旱葡萄品种选育具有局限性，现代分子育种尤其是基因编辑技术的诞生，为葡萄精准抗旱育种提供了一种高效可行的手段。因此，挖掘葡萄自身负调控抗旱的基因，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对其进行精确编辑，是从根本上提高葡萄自身抗旱性的重要途径。
[0003]MYB转录因子是植物中数量最多，功能最多样的转录因子家族，广泛参与植物形态发生和次生代谢，调控植物对生物和非生物胁迫的响应。MYB转录因子的N端都含有结构鲜明的、高度保守的DNA结合结构域—MYB结构域。在植物中，这个结构域通常由1
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4个不完全重复的氨基酸序列组成，每个不完全重复氨基酸序列约含52个氨基酸，形成3个α螺旋。其中第二和第三螺旋形成一个螺旋
‑
转角
‑
螺旋(HTH)结构。每个MYB区域中含有3个保守的色氨酸残基(一般间隔18或19个氨基酸)，在三维HTH结构中形成疏水核。每个重复序列的第三个螺旋是“识别螺旋”，它与特定的DNA序列紧密结合。不同于N端高度保守的DNA结合结构域，通常位于C端的激活或抑制结构域及无序序列变化丰富，使其能与其他不同类型蛋白结合，在植物生长发育与不同的逆境胁迫响应过程中发挥重要调控作用。
[0004]CRISPR/Cas9基因编辑技术通过人工设计的sgRNA识别基因组中的特定位置并引导Cas9蛋白对其双链DNA序列进行切割，断裂的双链DNA修复过程中易发生碱基的插入或缺失的错配现象，导致靶基因功能丧失或改变。由于欧洲葡萄抗旱基因匮乏，通过CRISPR/Cas9对负调控抗旱的基因定向编辑，可维持欧洲葡萄品种优良性状同时提高葡萄抗旱性，加速葡萄抗旱育种进程。
[0005]迄今为止，关于葡萄MYB转录因子调控干旱胁迫的研究较少，对于负调控葡萄抗旱的MYB转录因子更是鲜有报道。本文从欧洲葡萄
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赤霞珠
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中筛选到PEG(6000)模拟干旱处理中显著诱导的MYB转录因子VviMYB30。利用CRISPR/Cas9基因编辑体系敲除
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赤霞珠
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VviMYB30基因，显著提高了葡萄抗旱性，这为葡萄抗旱精准分子育种提供基因资源和分子标记，具有重要理论价值和实践意义。

技术实现思路

[0006]本申请从第一大酿酒葡萄品种
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赤霞珠
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中分离获得了的MYB转录因子基因VviMYB30，并证明其在葡萄抗旱中发挥负调控功能，本申请还涉及VviMYB30用于葡萄抗旱的用途。
[0007]在一个实施方案中，本申请的分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子基因
VviMYB30具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：
[0008][0009]本专利技术专利申请的一个方面涉及分离的抗旱负调控MYB转录因子，其由本申请所述的分离的抗旱负调控MYB转录因子VviMYB30编码，所述VviMYB30具有SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列。
[0010][0011]本专利技术专利申请的一个方面涉及分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子基因VviMYB30在创制抗旱基因编辑葡萄品种的用途。
[0012]本专利技术专利申请的一个方面涉及一种产生抗旱的基因编辑葡萄植株的方法，其特征在于在葡萄中将本申请所述的分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子VviMYB30基因编辑并稳定敲除或敲低。
[0013]因此，本专利技术专利申请的一个方面还涉及一种提高葡萄植株抗旱能力的方法，其特征在于在葡萄中将本申请所述的分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子VviMYB30基因敲除。
[0014]本专利技术提供
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赤霞珠
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葡萄MYB转录因子VviMYB30的实时荧光定量PCR检测引物以及内参基因VviActin7的引物，引物序列如下：
[0015]VviMYB30
‑
qF：5
’
GCCTTCATGGACACACAGTGGATCA3
’
(SEQ ID NO:2)
[0016]VviMYB30
‑
qR：5
’
ATCATCGCCAAGGTAAGGCATCCC 3
’
(SEQ ID NO:3)
[0017]VviActin7
‑
qF：5
’
CTATCCTTCGTCTTGACCTTGCTG 3
’
(SEQ ID NO:4)
[0018]VviActin7
‑
qR：5
’
AGTGGTGAACATGTAACCCCTCTC 3
’
(SEQ ID NO:5)
[0019]分别检测VviMYB30基因在
‘
赤霞珠
’
葡萄不同组织部位，PEG(6000)模拟干旱处理后的表达情况。结果表明，VviMYB30基因在根中表达量最高，且受PEG(6000)处理诱导表达。
[0020]本专利技术首次构建了35S::VviMYB30
‑
GFP植物表达载体，并通过农杆菌介导的转化法将其导入烟草叶肉细胞中，研究VviMYB30蛋白的亚细胞定位情况。结果表明，GFP标记的VviMYB30全长蛋白可与mCherry标记的细胞核驻留蛋白AtHY5共定位。
[0021]本专利技术创制了赤霞珠葡萄MYB转录因子VviMYB30基因编辑株系。经PCR检测和sange测序，确认VviMYB30基因被稳定编辑，导致翻译提前终止。待基因编辑葡萄株系和同龄的非基因编辑葡萄株系移栽至人工气候培养箱生长3个月后，对其进行干旱处理，通过对植株长势观察，发现VviMYB30基因编辑植株与野生型相比表现出更抗旱的表型，叶片失水萎蔫更慢。测定葡萄叶片细胞膜受损代谢产物丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性，发现干旱胁迫下VviMYB30基因编辑植株与野生型相比丙二醛含量显著降低，POD酶活性显著升高，表明VviMYB30基因敲除后，减缓了干旱导致的葡萄细胞膜受损，加速过氧化物分解，使得葡萄对干旱具有更强的耐受性。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023](1)本专利技术通过克隆技术从欧洲葡萄
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赤霞珠
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获得了分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子VviMYB30。利用CRISPR/Cas9在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子基因VviMYB30，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.MYB转录因子，其由权利要求1所述的分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子基因VviMYB30编码，所述MYB转录因子具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。3.权利要求1所述的分离的负调控抗旱的葡萄MYB转录因子基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：文颖强，余雪娜，卢梦娇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：