一种牛源A型多杀性巴氏杆菌减毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种牛源A型多杀性巴氏杆菌减毒株及其制备方法和应用，属于生物制品技术领域。本发明专利技术提供的牛源A型多杀性巴氏杆菌减毒株PmCQ2Δ889

【技术实现步骤摘要】
一种牛源A型多杀性巴氏杆菌减毒株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种牛源A型多杀性巴氏杆菌减毒株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]多杀性巴氏杆菌是一种重要的人畜共患致病菌，可导致多种家禽家畜，甚至人类患病，主要包括禽霍乱、猪的萎缩性鼻炎和肺疫、牛羊的出血性败血病和肺炎等。这给养殖业带来了巨大的经济损失，同时也威胁着人类的生命安全。
[0003]根据荚膜血清型不同，多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E和F型五种血清型，A型主要引起牛肺炎。该病的防控主要以抗生素和疫苗为主，但是抗生素滥用存在耐药和环境污染等问题，疫苗防控是预防该病的主要措施。疫苗的制备一般采用减毒株制备得到。目前为止，国内尚无针对A型多杀性巴氏杆菌的有效疫苗，且不同血清型疫苗间交叉保护作用较差。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株，通过缺失野生型多杀性巴氏杆菌基因组中889，890，891，892，893和894这6个基因，降低了动物的致病力，同时对多种血清型多杀性巴氏杆菌具有一定的保护作用。
[0005]本专利技术提供了一种牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株，在牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基础上，缺失基因组中889，890，891，892，893和894基因。
[0006]优选的，889基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0007]890基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0008]891基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0009]892基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0010]893基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0011]894基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]本专利技术提供了所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株的构建方法，包括以下步骤：
[0013]以牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基因组DNA为模板，分别以引物Pm889
‑
894U
‑
F/Pm889
‑
894U
‑
R扩增Pm889
‑
894基因的上游同源臂，用引物Pm889
‑
894D
‑
F/Pm889
‑
894D
‑
R扩增Pm889
‑
894基因的下游同源臂；
[0014]将所述Pm889
‑
894基因的上游同源臂和扩增Pm889
‑
894基因的下游同源臂克隆至pUC19oriKan
R
质粒中，得到缺失基因重组质粒pUC19oriKanRΔ889
‑
894；
[0015]将所述缺失基因重组质粒pUC19oriKanRΔ889
‑
894转化入PmCQ2感受态细胞中，得到PmCQ2Δ889
‑
894。
[0016]优选的，所述引物Pm889
‑
894U
‑
F/Pm889
‑
894U
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和
SEQ ID NO:8所示。
[0017]优选的，所述引物Pm889
‑
894D
‑
F/Pm889
‑
894D
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
[0018]优选的，所述克隆的方法为将pUC19oriKan
R
质粒分别用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切，将Pm889
‑
894基因的上游同源臂和扩增Pm889
‑
894基因的下游同源臂连接至酶切后的pUC19oriKan
R
质粒中，得到缺失基因重组质粒pUC19oriKanRΔ889
‑
894。
[0019]优选的，所述转化的方法包括电转化；
[0020]所述电转化的电击电压为2500V，电阻500欧，所述电转化的时间为5ms。
[0021]本专利技术提供了所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株或所述构建方法得到的牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株在制备广谱多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
[0022]优选的，广谱多杀性巴氏杆菌疫苗包括A型多杀性巴氏杆菌疫苗、B型多杀性巴氏杆菌疫苗和F型多杀性巴氏杆菌疫苗。
[0023]本专利技术提供了一种广谱多杀性巴氏杆菌疫苗，包括佐剂和所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株或所述构建方法得到的牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株。
[0024]本专利技术提供了一种牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株，在牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基础上，缺失基因组中889，890，891，892，893和894基因。本专利技术通过同源重组方式缺失牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基因组中889，890，891，892，893和894基因，使获得的突变株的菌体变小，荚膜含量降低，对小鼠的致病力显著减弱，对A型和B型多杀性巴氏杆菌具有良好的免疫保护作用，对F型多杀性巴氏杆菌菌株也能起到一定的保护作用，是制备疫苗的良好候选毒株。
[0025]同时本专利技术提供的A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
‑
894减毒株具有良好的遗传稳定性，传代30代后依然保持基因突变性状，不发生回复突变。这表明本专利技术提供的A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株能够很好的用于防治多杀性巴氏杆菌感染。
[0026]与现有技术相比，本专利技术提供的广谱多杀性巴氏杆菌疫苗，具有以下有益效果：1)目前国内尚无商品化的有效牛源A型多杀性巴氏杆菌疫苗，该疫苗的研发，能够有效预防牛源A型多杀性巴氏杆菌感染，减少因该病造成的养殖业经济损失。
[0027]2)该疫苗毒性弱，稳定性好，且具有交叉保护作用，可有效防治A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的感染。
[0028]3)该疫苗的研发，可减少牛源A型多杀性巴氏杆菌的感染，从而降低抗生素造成的耐药及环境污染等问题。
附图说明
[0029]图1为目的基因Pm889
‑
984上、下游同源臂的扩增结果，其中M：DL2000的Marker；1：Pm889
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894上游同源臂；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株，其特征在于，在牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基础上，缺失基因组中889，890，891，892，893和894基因。2.根据权利要求1所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株，其特征在于，889基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；890基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；891基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；892基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；893基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；894基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.权利要求1所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2的基因组DNA为模板，分别以引物Pm889
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894U
‑
F/Pm889
‑
894U
‑
R扩增Pm889
‑
894基因的上游同源臂，用引物Pm889
‑
894D
‑
F/Pm889
‑
894D
‑
R扩增Pm889
‑
894基因的下游同源臂；将所述Pm889
‑
894基因的上游同源臂和扩增Pm889
‑
894基因的下游同源臂克隆至pUC19oriKan
R
质粒中，得到缺失基因重组质粒pUC19oriKanRΔ889
‑
894；将所述缺失基因重组质粒pUC19oriKanRΔ889
‑
894转化入PmCQ2感受态细胞中，得到PmCQ2Δ889
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894。4.根据权利要求3所述牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2Δ889
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894减毒株的构建方法，其特征在于，所述引物Pm889
‑
894U
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭远义，何芳，张慧慧，李能章，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：