在细胞中的含有GlcNAc的生物产品的产生制造技术

本发明专利技术是属于合成生物学和代谢工程的技术领域。更具体而言，本发明专利技术是属于代谢工程细胞的培养及发酵的技术领域。本发明专利技术描述通过细胞产生还原端具有N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在细胞中的含有GlcNAc的生物产品的产生
[0001]本专利技术是属于合成生物学和代谢工程的
更具体而言，本专利技术是属于代谢工程细胞的培养或发酵的
本专利技术描述一种通过细胞产生在还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元(N
‑
acetylglucosamine unit)的双糖或寡糖以及从培养物中纯化该双糖或寡糖的方法。此外，本专利技术提供一种代谢工程化的细胞，其用于产生在还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元的双糖或寡糖。
[0002]引言
[0003]碳水化合物经常以蛋白质和脂质的糖
‑
共轭形式存在，参与许多重要现象，例如与受精、胚胎发生、发炎、转移(metastasis)和宿主病原体黏附的发展和进程相关的分化、发展和生物识别过程。碳水化合物也可于体液和母乳中以未共轭的聚糖存在，其中其也调节重要的发展及免疫过程(Bode,Early Hum.Dev.1
‑
4(2015)；Reily et al.,Nat.Rev.Nephrol.15,346
‑
366(2019)；Varki,Glycobiology 27,3
‑
49(2017))。
[0004]双糖Galβ1,3GlcNAc，也称为lacto
‑
N
‑
biose、LNB、第1型N
‑
乙酰乳糖胺(N
‑
acetyllactosamine type 1)或第1型LacNAc，其由β
‑
1,3连接至N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的半乳糖组成。GlcNAc存在于双糖的还原端。LNB已知是几种重要血型表位的前驱物，例如路易斯(Lewis)A、路易斯B或唾液酸化路易斯A。含有聚糖的第1型LacNAc也在肿瘤转移中具有重要的作用，因此被视为肿瘤标志物(Molecules 22,1320(2017))。它们也是黏蛋白型糖蛋白的重要成分。广布的双糖Galβ1,4GlcNAc，也称为N
‑
乙酰乳糖胺、LacNAc或第2型LacNAc，其由β
‑
1,4连接至N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的半乳糖组成。同样地，GlcNAc存在于双糖的还原端。LacNAc经常在癌细胞表面过度表达，在癌细胞表面其与肿瘤分泌的半乳糖凝集素(galectins)结合，以促进癌症相关过程，如转移、黏附、肿瘤存活及免疫逃脱(Romano and Oscarson,Org.Biomol.Chem.17,2265
‑
2278(2019))。LacNAc也为路易斯X、路易斯Y和唾液酸化路易斯X表位的一部分。第1型(Galβ1,3GlcNAc)及第2型(Galβ1,4GlcNAc)两者的二聚及延长的LacNAc结构和聚
‑
N
‑
乙酰乳糖胺(poly
‑
LacNAc)通常与发炎进程及癌症相关。双糖LNB和LacNAc及其部分和路易斯型表位也存在于人乳中，作为人乳寡糖(HMO)组合物的一部分(Prudden etal.,PNAS USA 114,6954
‑
6959(2017))。存在于结肠中的部分的双叉乳杆菌(Bifidobacterium)物种能够特定消耗HMO，例如LNB或含有糖类的LNB。一些乳酸杆菌(lactobacilli)(例如干酪乳杆菌(L.casei))已显示可以在泌乳早期代谢人乳中存在的LacNAc双糖(Bidart et al.,Sci.Rep.8,7152(2018))。因此，乳酸杆菌和双叉乳杆菌占母乳喂养的婴儿的总肠道菌相(total gut flora)达90％(et al.,Molecules 22,1320(2017))。
[0005]由于这些在还原端具有GlcNAc的双糖及寡糖参与大量(plethora)的重要进程，因此有许多制药及营养品关注在开发新型N
‑
乙酰乳糖胺类(第1型或第2型)的治疗剂或有益的营养化合物。相当多的努力投入在发展聚糖(如双糖LNB和LacNAc)或在还原端含有LNB或LacNAc的聚糖的合成制程上。
[0006]化学合成方法是费力和费时的，而且由于涉及大量的步骤，其很难进行扩大规模。生物催化方式提供许多优势，因此有大量与产生LNB、LacNAc及其变体有关的公开。
al.(RSC Advances 3(30)(2013))报告使用来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的经纯化β
‑
Gal
‑
3半乳糖苷酶，以自补充有p
‑
NP
‑
Gal作为供给者且补充有GlcNAc作为接受者的生质中产生LNB。专利申请案JP2017195793A另一种半乳糖苷酶，由一种芽孢杆菌(Bacillus species)重组产生并从芽孢杆菌中纯化，以用于经由水解体外合成例如LNB的半乳寡糖(galacto
‑
oligosaccharide)。其他报告利用来自双歧杆菌(Bifidobacteria)的LNB磷酸化酶，在从蔗糖和补充GlcNAc起始的酶反应混合物，另外补充有蔗糖磷酸化酶、UDP
‑
葡萄糖
‑
己糖
‑1‑
磷酸尿苷酰转移酶(UDP
‑
glucose
‑
hexose
‑1‑
phosphate uridylyltransferase)和UDP
‑
葡萄糖4
‑
表异构酶(UDP
‑
glucose 4
‑
epimerase)，以产生LNB(Nishimoto and Kitaoka,Biosci.Biotechnol.Biochem.71,2101
‑
2104(2007)；Nishimoto,Biosci.Biotechnol.Biochem.84,17
‑
24(2020)；US2010120096A；JP4264742 B2；JP2005341883 A2)。并且，提出一种使用含有半乳糖、GlcNAc、半乳糖激酶与LNB磷酸化酶一起的体外反应混合物(CN110527704 A)。经常报导的另一种作用方式是利用偶合偶接以进行催化转化。在这样的例子中，表达参与本专利技术的糖类催化途径的酶的几个重组细菌菌株被培育和裂解，以获得分解反应混合物中必要的酶。专利申请案JP2013201913的专利技术人描述了在含有补充蔗糖、GlcNAc、磷酸盐、UDP
‑
葡萄糖及/或UDP
‑
半乳糖的混合物中，将布氏双叉乳杆菌(Bifidobacterium breve)MCC1320或婴儿双叉乳杆菌菌株(Bifidobacterium infantis strain)和长双叉乳杆菌菌株(B.long本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种通过细胞，优选为单一细胞，产生还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元的寡糖或双糖的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供细胞，所述细胞能够：(i)合成核苷酸
‑
糖及单糖N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)且(ii)表达糖基转移酶以糖化所述GlcNAc单糖，而产生所述双糖或寡糖，b.在允许产生所述双糖或寡糖的条件下培养所述细胞，c.优选地，自培养物分离所述双糖或寡糖。2.一种通过细胞产生还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元的寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供细胞，所述细胞能够：(i)合成核苷酸
‑
糖及单糖N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)且(ii)表达糖基转移酶以糖化所述GlcNAc单糖，而产生所述寡糖，b.在允许产生所述寡糖的条件下培养所述细胞，c.优选地，自所述培养物分离所述寡糖。3.一种通过细胞产生混合物的方法，所述混合物包括(i)还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元的双糖及/或寡糖、及(ii)一或多种基于乳糖的哺乳动物乳寡糖(MMOs)，所述方法包括以下步骤：a.提供细胞，所述细胞能够：(i)合成核苷酸
‑
糖及单糖N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)且(ii)表达糖基转移酶以糖化所述GlcNAc单糖，而产生所述还原端具有N
‑
乙酰葡萄糖胺单元的双糖及/或寡糖，b.在允许产生所述混合物的条件下培养所述细胞，c.优选地，自培养物分离所述混合物。4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞表达至少一种N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸转移酶及磷酸酶，以合成所述单糖N
‑
乙酰葡萄糖胺。5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞表达至少一种糖基转移酶，以糖化N
‑
乙酰葡萄糖胺。6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经基因改造以产生所述双糖或寡糖。7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞以一或多种基因表达模组进行修饰，其特征在于任何所述表达模组的表达形式是组成型或由天然诱导物所产生。8.如权利要求6或7中任一项所述的方法，其中所述细胞包括编码一蛋白质的相同编码DNA序列的多个复制。9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在选自包括下列的群组的酶的表达或活性方面被修饰：N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸转移酶、磷酸酶、糖基转移酶、L
‑
谷氨酰胺—D
‑
果糖
‑6‑
磷酸转氨酶及UDP
‑
葡萄糖4
‑
表异构酶。10.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核苷酸
‑
糖选自包含下列的群组：UDP
‑
半乳糖(UDP
‑
Gal)、UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺(UDP
‑
GlcNAc)、UDP
‑
N
‑
乙酰半乳糖胺(UDP
‑
GalNAc)、UDP
‑
N
‑
乙酰甘露糖胺(UDP
‑
ManNAc)、GDP
‑
岩藻糖(GDP
‑
Fuc)、GDP
‑
甘露糖(GDP
‑
Man)、UDP
‑
葡萄糖(UDP
‑
Glc)、UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑‑
L阿拉伯
‑4‑
己酮糖、UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑‑
L
‑
来苏
‑4‑
己酮糖、UDP
‑
N
‑
乙酰基
‑
L
‑
鼠李糖胺(UDP
‑
L
‑
RhaNAc或UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑
L
‑
甘露糖)、dTDP
‑
N
‑
乙酰岩藻糖胺、UDP
‑
N
‑
乙酰岩藻糖胺(UDP
‑
L
‑
FucNAc或UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑
L
‑
半乳糖)、UDP
‑
N
‑
乙酰基
‑
L
‑
肺炎糖胺(UDP
‑
L
‑
PneNAC或UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑
L
‑
塔罗糖)、UDP
‑
N
‑
乙酰胞壁酸、UDP
‑
N
‑
乙酰基
‑
L
‑
奎诺糖胺(UDP
‑
L
‑
QuiNAc或UDP
‑2‑
乙酰胺基
‑
2,6
‑
双去氧
‑
L
‑
葡萄糖)、GDP
‑
L
‑
异鼠李糖、CMP
‑
N
‑
乙酰基神经氨酸(CMP
‑
Neu5Ac)、CMP
‑
N
‑
乙醇酰神经氨酸(CMP
‑
Neu5Gc)、CMP
‑
Neu4Ac、CMP
‑
Neu5Ac9N3、CMP
‑
Neu4,5Ac2、CMP
‑
Neu5,7Ac2、CMP
‑
Neu5,9Ac2、CMP
‑
Neu5,7(8,9)Ac2、UDP
‑
葡萄糖醛酸盐、UDP
‑
半乳糖醛酸盐、GDP
‑
鼠李糖及UDP
‑
木糖。11.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核苷酸
‑
糖为UDP
‑
半乳糖，且所述糖基转移酶为N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶或N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶。12.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述寡糖在所述还原端具有乳
‑
N
‑
双糖(Gal
‑
b1,3
‑
GlcNAc)或N
‑
乙酰乳糖胺(Gal
‑
b1,4
‑
GlcNAc)。13.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶为糖基转移酶，其具有：a.PFAM域PF00535，且i.包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X
n
)RXDXD，其中X是任何氨基酸，其中n为12至17，或ii.包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X
n
)RXDXD(X
m
)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何氨基酸，其中n是12至17且m是100至115，或iii.包括根据SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列，或iv.为SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶多肽全长的至少80％整体序列同一性且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或v.包括来自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或vi.为SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或vii.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，优选为SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更优选为SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最优选为SEQ ID NO 03或06中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或者b.PFAM域IPR002659，且
i.包括SEQ ID NO 09的序列KT(X
n
)[FY]XXKXDXD(X
m
)[FHY]XXG(X，无A、G、S)(X
p
)X(无F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何氨基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或ii.包括根据SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或iii.为SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：10、11、12或13的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶多肽中的任一全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或iv.包括来自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或v.为SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性，或vi.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶活性。14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶为糖基转移酶，其具有：a.PFAM域PF01755，且i.包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X
n
)EDD(X
m
)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何氨基酸，其中n为13至15且m是50至76，或ii.包括根据SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列，或iii.为SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶多肽中全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或iv.包括来自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或v.为SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ IDNO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或vi.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，优选为SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更优选为SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙
酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或者b.PFAM域PF00535，且i.包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X
n
)[FHW]XXX[FHNY](X
m
)E[DE]，其中X是任何氨基酸，其中n是50至75，m是10至30，或ii.包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X
n
)[FHW]XXX[FHNY](X
m
)E[DE](X
p
)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何氨基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或iii.包括根据SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或iv.为SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：26、27或28的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶多肽中的任一全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或v.包括来自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或vi.为SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或vii.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或者c.PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且viii.包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X
23
)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何氨基酸，或ix.包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X
n
)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何氨基酸，其中n是21至24，或x.包括根据SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或xi.为SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶多肽中的任一全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xii.包括来自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xiii.为SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xiv.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或d.PFAM域PF03808，且viii.包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X
n
)DG(X
16
)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中
X是任何氨基酸，且其中n是20至25，或ix.包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X
n
)DG(X
16
)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X
m
)[HR]XG[FWY](X
p
)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何氨基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或x.包括根据SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或xi.为SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与SEQ ID NO：39、40或41的所述N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶多肽中的任一全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xii.包括来自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续氨基酸残基的寡肽序列，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xiii.为SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性，或xiv.包括多肽，所述多肽包括或由具有与SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全长氨基酸序列的至少80％序列同一性的氨基酸序列所组成，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺b
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶活性。15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中a.所述N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸转移酶为包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列、或为UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与UniProt ID P43577的多肽全长的至少80％整体序列同一性，且具有N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸转移酶活性，以及b.所述L
‑
谷氨酰胺—D
‑
果糖
‑6‑
磷酸转氨酶为包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列、或为具有UniProtID P17169的多肽的功能性同源物、变体或衍生物，其具有与UniProt ID P17169的多肽全长的至少80％整体序列同一性，且具有L
‑
谷氨酰胺—D
‑
果糖
‑6‑
磷酸转氨酶活性；或为与UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突变的修饰版本。16.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞能够代谢碳源，所述碳源选自包含下列列举的群组：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽
‑
寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、玉米浸液、高果糖浆、糖蜜、甘油、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸、丙酮酸。17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞无法将N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸盐转换成葡萄糖胺
‑6‑
磷酸盐，及/或无法将葡萄糖胺
‑6‑
磷酸盐转换成果糖
‑6‑
磷酸盐。18.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以产生GDP
‑
岩藻糖。19.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以促进GDP
‑
岩藻糖产生，且所述修饰选择自包含下列列举的群组：UDP
‑
葡萄糖：十一异戊二烯
‑
磷酸葡萄糖
‑1‑
磷酸转移酶编码基因的剃除、GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶编码基因的过度表达、GDP
‑
甘露糖4,6
‑
脱水酶编码基因的过度表达、甘露糖
‑1‑
磷酸盐鸟苷酸转移酶编码基因的过度表达、磷酸甘露糖变位酶编码基因的过度表达、或甘露糖
‑6‑
磷酸盐异构酶编码基因的过度表达。20.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以产生UDP
‑
半乳糖。
21.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以促进UDP
‑
半乳糖产生，且所述修饰选择自包含下列列举的群组：5
’‑
核苷酸酶/UDP
‑
糖水解酶编码基因的剃除或半乳糖
‑1‑
磷酸盐尿苷酰转移酶编码基因的剃除。22.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以产生CMP
‑
N
‑
乙酰基神经氨酸。23.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞经修饰以促进CMP
‑
N
‑
乙酰基神经氨酸产生，且所述修饰选择自包含下列列举的群组：CMP
‑
唾液酸合成酶编码基因的过度表达、唾液酸合成酶编码基因的过度表达、N
‑
乙酰基
‑
D
‑
葡萄糖胺2
‑
表异构酶编码基因的过度表达。24.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞能够表达至少一种其他糖基转移酶，且其中所述其他糖基转移酶选自包括下列的群组：岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N
‑
乙酰基葡糖胺转移酶、N
‑
乙酰基半乳糖胺转移酶、N
‑
乙酰基甘露糖胺转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖醛酸苷转移酶、半乳糖醛酸转移酶、葡萄糖胺转移酶、N
‑
乙醇酰神经胺转移酶、鼠李糖基转移酶、N
‑
乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP
‑4‑
氨基
‑
4,6
‑
双去氧
‑
N
‑
乙酰基
‑
β
‑
L
‑
阿卓糖胺转氨酶、UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺烯醇丙酮基转移酶和岩藻糖胺基转移酶，
‑
优选地，所述岩藻糖基转移酶选自包括下列列举：α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶、α
‑
1,3
‑
岩藻糖基转移酶、α
‑
1,4
‑
岩藻糖基转移酶及α
‑
1,6
‑
岩藻糖基转移酶，
‑
优选地，所述唾液酸转移酶选自包括下列列举：α
‑
2,3
‑
唾液酸转移酶、α
‑
2,6
‑
唾液酸转移酶及α
‑
2,8
‑
唾液酸转移酶，
‑
优选地，所述半乳糖基转移酶选自包括下列列举：β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶、N
‑
乙酰葡萄糖胺β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶、β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶、N
‑
乙酰葡萄糖胺β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶、α
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶及α
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶，
‑
优选地，所述葡萄糖基转移酶选自包括下列列举：α
‑
葡萄糖基转移酶、β
‑
1,2
‑
葡萄糖基转移酶、β
‑
1,3
‑
葡萄糖基转移酶及β
‑
1,4
‑
葡萄糖基转移酶，
‑
优选地，所述甘露糖基转移酶选自包括下列列举：α
‑
1,2
‑
甘露糖基转移酶、α
‑
1,3
‑
甘露糖基转移酶及α
‑
1,6
‑
甘露糖基转移酶，
‑
优选地，所述N
‑
乙酰基葡糖胺转移酶选自包括下列列举：β
‑
1,3
‑
N
‑
乙酰基葡糖胺转移酶及β
‑
1,6
‑
N
‑
乙酰基葡糖胺转移酶，
‑
优选地，所述N
‑
乙酰基半乳糖胺转移酶为α
‑
1,3
‑
N
‑
乙酰基半乳糖胺转移酶。25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞在所述其他糖基转移酶的表达或活性方面被修饰。26.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞使用用于产生所述在还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖的一或多种前驱物，所述前驱物从培养基供给所述细胞。27.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞产生一或多种前驱物，所述前驱物用于产生所述在还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖。28.如权利要求26或27中任一项所述的方法，其中用于产生所述双糖或寡糖的所述前驱物完全转化为所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖。29.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在细胞内产生所述还原端具
有GlcNAc单元的双糖或寡糖，且其中部分或实质上全部的所产生的所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖保留在细胞内及/或经由被动或主动运输排出所述细胞外。30.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞表达膜转运蛋白或具有转运活性的多肽，以转运化合物穿过细胞壁的外膜，优选地，所述细胞在所述膜转运蛋白或具有转运活性的多肽的表达或活性方面被修饰。31.如权利要求30所述的方法，其中所述膜转运蛋白或具有转运活性的多肽选自包括下列列举：运输蛋白、P
‑
P
‑
键
‑
水解
‑
驱动的转运体、β
‑
桶状孔蛋白、辅助转运蛋白、推定转运蛋白及磷酸转移
‑
驱动组转位蛋白，优选地，所述运输蛋白包括MFS转运体、糖排出转运体及螯铁蛋白输出体，优选地，所述P
‑
P
‑
键
‑
水解
‑
驱动的转运体包括ABC转运体及螯铁蛋白输出体。32.如权利要求30或31中任一项所述的方法，其中所述膜转运蛋白或具有转运活性的多肽控制所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖及/或一或多种前驱物及/或接受者在细胞壁外膜上的流动，所述一或多种前驱物及/或接受者用于产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖。33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述膜转运蛋白或具有转运活性的多肽提供所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖的改善产生及/或允许排出及/或促进排出。34.如权利要求6至33中任一项所述的方法，其中所述细胞包括与未修饰的先驱细胞相比，用于降低乙酸盐产生的修饰。35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞包括与未修饰的先驱细胞相比，任一或多种蛋白质的较低或减少的表达及/或消除、受损、降低或延迟的活性，所述蛋白质包含：β
‑
半乳糖苷酶、半乳糖苷O
‑
乙酰转移酶、N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑6‑
磷酸盐去乙酰酶、葡萄糖胺
‑6‑
磷酸盐脱胺酶、N
‑
乙酰葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA
‑
Nag、UDP
‑
葡萄糖：十一异戊二烯
‑
磷酸葡萄糖
‑1‑
磷酸转移酶、L
‑
岩藻酮糖激酶、L
‑
岩藻糖异构酶、N
‑
乙酰神经氨酸解离酶、N
‑
乙酰甘露糖胺激酶、N
‑
乙酰甘露糖胺
‑6‑
磷酸盐2
‑
表异构酶、EIIAB
‑
Man、EIIC
‑
Man、EIID
‑
Man、ushA、半乳糖
‑1‑
磷酸盐尿苷酰转移酶、葡萄糖
‑1‑
磷酸盐腺苷酰转移酶、葡萄糖
‑1‑
磷酸酶、ATP
‑
依赖性6
‑
磷酸果糖激酶同功酶1、ATP
‑
依赖性6
‑
磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸盐异构酶、有氧呼吸调控蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性转位磷酸转移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特异性转位磷酸转移酶(PTS)酶IIBC成分malX、enzyme IIA
Glc
、β
‑
葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸
‑
甲酸盐解离酶、乙酸盐激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸去羧酶。36.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。37.如权利要求6至36中任一项所述的方法，其中所述细胞与未修饰的先驱细胞相比，具有用于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的促进产生及/或供应的修饰。38.如权利要求6至37中任一项所述的方法，其中所述细胞包含至少部分失活的所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢途径，所述单糖、双糖或寡糖参与所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖的产生及/或为产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖所需。
39.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述细胞在乳糖与一或多种其他碳源结合的环境中生长时，所述细胞抵抗乳糖杀伤现象。40.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在整个培养液及/或上清液产生90g/L或多于90g/L的所述还原端具有GlcNAc的双糖或寡糖、及/或其中在整个培养液及/或上清液中的所述还原端具有GlcNAc的双糖或寡糖具有至少80％的纯度，其在整个培养液及/或上清液中分别以所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖及其前驱物的总量计。41.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在培养基中稳定地培养。42.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述条件包括：
‑
使用包括至少一种前驱物及/或接受者的培养基，以用于产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖，及/或
‑
添加至少一种前驱物及/或接受者原料至培养基，以用于产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖。43.如上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括下列步骤中的至少一者：vi)使用包括至少一种前驱物及/或接受者的培养基；vii)向反应器中的培养基添加至少一种前驱物及/或接受者原料，其中总反应器体积范围为250mL(毫升)至10,000m3(立方米)，优选以连续方式，并且优选使得培养基的最终体积不超过在添加所述前驱物及/或接受者原料之前的培养基体积的三倍，优选不超过两倍，更优选小于两倍；viii)向反应器中的培养基添加至少一种前驱物及/或接受者原料，其中总反应器体积范围为250mL(毫升)至10,000m3(立方米)，优选以连续方式，并且优选使得培养基的最终体积不超过在添加所述前驱物及/或接受者原料之前的培养基体积的三倍，优选不超过两倍，更优选小于两倍，且优选地，所述前驱物及/或接受者原料的pH设定在3与7之间，且优选地，所述前驱物及/或接受者原料的温度维持在20℃与80℃之间；ix)通过进料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的过程中以连续方式添加至少一种前驱物及/或接受者原料至培养基；x)通过进料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的过程中以连续方式添加至少一种前驱物及/或接受者原料至培养基，且优选地，所述进料溶液的pH设定在3与7之间，且优选地，所述前驱物及/或接受者原料的温度维持在20℃与80℃之间；所述方法产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖，其在最终培养物中的浓度为至少50g/L，优选为至少75g/L，更优选为至少90g/L，更优选为至少100g/L，更优选为至少125g/L，更优选为至少150g/L，更优选为至少175g/L，更优选为至少200g/L。44.如权利要求1至42中任一项所述的方法，所述方法包括下列步骤中的至少一者：vi)使用每公升初始反应器体积包含至少50克，更优选为至少75克，更优选为至少100克，更优选为至少120克，更优选为至少150克乳糖的培养基，其中反应器体积范围为250mL至10,000m3(立方米)；vii)以每公升初始反应器体积包含至少50克，更优选为至少75克，更优选为至少100克，更优选为至少120克，更优选为至少150克乳糖的乳糖原料添加至培养基，其中反应器体积范围为250mL至10,000m3(立方米)，优选以连续方式，且优选地，使得所述培养基的最终体积不超过在添加所述乳糖原料之前的培养基体积的三倍，优选不超过两倍，更优选小于
两倍；viii)以每公升初始反应器体积包含至少50克，更优选为至少75克，更优选为至少100克，更优选为至少120克，更优选为至少150克乳糖的乳糖原料添加至培养基，其中反应器体积范围为250mL至10,000m3(立方米)，优选以连续方式，且优选地，使得所述培养基的最终体积不超过在添加所述乳糖原料之前的培养基体积的三倍，优选不超过两倍，更优选小于两倍，且优选地，所述乳糖原料的pH设定在3与7之间，且优选地，所述乳糖原料的温度维持在20℃与80℃之间；ix)通过进料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的过程中以连续方式添加乳糖原料至培养基；x)通过进料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的过程中以连续方式添加乳糖原料至培养基，其中所述乳糖进料溶液的浓度为50g/L，优选为75g/L，更优选为100g/L，更优选为125g/L，更优选为150g/L，更优选为175g/L，更优选为200g/L，更优选为225g/L，更优选为250g/L，更优选为275g/L，更优选为300g/L，更优选为325g/L，更优选为350g/L，更优选为375g/L，更优选为400g/L，更优选为450g/L，更优选为500g/L，又更优选为550g/L，最优选为600g/L；以及其中优选地，所述进料溶液的pH设定在3与7之间，且优选地，所述前驱物及/或接受者原料的温度维持在20℃与80℃之间；所述方法产生所述还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖，其在最终培养物中的浓度为至少50g/L，优选为至少75g/L，更优选为至少90g/L，更优选为至少100g/L，更优选为至少125g/L，更优选为至少150g/L，更优选为至少175g/L，更优选为至少200g/L。45.如权利要求44所述的方法，其中所述乳糖原料是通过从培养开始以至少5mM，优选以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度添加乳糖，更优选为以>300mM的浓度添加乳糖而完成。46.如权利要求44或45中任一项所述的方法，其中所述乳糖原料是通过将乳糖以一定浓度添加至培养物中而完成，使得在培养物的整个生产阶段获得至少5mM，优选为10mM或30mM的乳糖浓度。47.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。48.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含选自包括乳糖、半乳糖、岩藻糖及唾液酸的群组的至少一种前驱物。49.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中通过向包含前驱物的培养基添加碳类基质，优选为葡萄糖或蔗糖，而提供指数细胞生长的第一阶段，接着在第二阶段，仅将碳类基质，优选为葡萄糖或蔗糖，添加到培养基中。50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中通过向包含前驱物的培养基中加入碳类基质，优选为葡萄糖或蔗糖，而提供指数细胞生长的第一阶段，接着在第二阶段，其中碳类基质，优选为葡萄糖或蔗糖，及前驱物添加到培养基中。51.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞产生带电的混合物，所述混合物为包含至少一种还原端具有GlcNAc单元的双糖或寡糖，优选为唾液酸化的双糖及/或寡糖及/或中性的双糖及/或寡糖。52.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞产生带电的混合物，所述混合
物为包含至少还原端具有GlcNAc单元的寡糖，优选为唾液酸化的寡糖及/或中性的寡糖。53.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述寡糖选自包括下列的列举：2
‑
岩藻糖基乳
‑
N
‑
双糖、4
‑
岩藻糖基乳
‑
N
‑
双糖、2
‑4‑
二岩藻糖基乳
‑
N
‑
双糖、3
’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、6
’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、3
’
,6
’‑
二唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、6,6
’‑
二唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、2
’‑
岩藻糖基
‑3’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、2
’‑
岩藻糖基
‑6’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、4
‑
岩藻糖基
‑3’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、4
‑
岩藻糖基
‑6’‑
唾液酸乳
‑
N
‑
双糖、2
‑
岩藻糖基N
‑
乙酰乳糖胺、3
’‑
岩藻糖基N
‑
乙酰乳糖胺、2,3
’‑
二岩藻糖基N
‑
乙酰乳糖胺、3
’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、6
’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、3
’
,6
’‑
二唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、6,6
’‑
二唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、2
’‑
岩藻糖基
‑3’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、2
’‑
岩藻糖基
‑6’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、3
‑
岩藻糖基
‑3’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、3
’‑
岩藻糖基
‑6’‑
唾液酸N
‑
乙酰乳糖胺、P1三糖(Gal
‑
a1,4
‑
Gal

【专利技术属性】
技术研发人员：苏菲，
申请(专利权)人：因比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：