柠檬烯环氧水解酶突变体及其催化合成手性氧/氮-杂环化合物制造技术

本发明专利技术应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(Rhodococcuserythropolis DCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造，获得了对以4

【技术实现步骤摘要】
柠檬烯环氧水解酶突变体及其催化合成手性氧/氮
‑
杂环化合物


[0001]本专利技术属于生物
，具体柠檬烯环氧水解酶突变体，更具体涉及应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(Rhodococcuserythropolis DCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造获得的柠檬烯环氧水解酶突变体以及这些突变体作为生物催化剂在手性氧杂环化合物中的应用。

技术介绍

[0002]手性氧/氮
‑
杂环化合物是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体，如抗生素药物莫能菌素与克林霉素、抗癌活性药物艾瑞布林、外用抗感染药莫匹罗星以及抗抑郁药帕罗西汀等。
[0003]目前，合成手性氧/氮
‑
杂环化合物有两种方法：化学法和生物合成法。化学合成方法有：使用钴复合物为催化剂进行氧杂环丁烷分子内的开环去对称化(Loy et al.,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,2786
‑
2787)，微波加热条件下手性氯代多醇的分子内脱氯环化(Kang et al.,O本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，其特征在于，将位于柠檬烯环氧水解酶催化中心口袋的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质，优选地是柠檬烯环氧水解酶LEH活性中心和控制手性重要位点的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。2.如权利要求1所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，其特征在于，所述至少一个氨基酸残基为柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位、第55位、第80位、第 83位，第114位，第116位所示的氨基酸残基；优选地，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体是将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位和/或第55位和/或第80位和/或第83位和/或第114位和/或第116位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质；更优选的，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体包括如下至少一种突变：将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位由酪氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸或者缬氨酸或苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第55位的天冬酰胺突变为脯氨酸或丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸；进一步优选，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体为如下（1）
‑
（9）中任一种：（1）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（2）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（3）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为缬氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（4）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（5）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（6）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（7）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（8）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；（9）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
上述蛋白质中所述柠檬烯环氧水解酶LEH的野生型是氨基酸序列如 SEQ ID No.1所示的柠檬烯环氧水解酶LEH或其来源于同一物种的同源基因编码的柠檬烯环氧水解酶LEH。3.如权利要求1或2所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白，优选地，在其 N 端或/和 C 端连接标签得到的融合蛋白质，更优选地所述标签是Poly
‑
Arg、Poly
‑
His、FLAG、Strep
‑
tag II或c
‑
myc，更具体地是RRRRR、HHHHHH、DYKDDDDK、WSHPQFEK或EQKLISEEDL。4.编码如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或如权利要求3所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白的编码核酸分子，优选地，所述核酸分子是 DNA，如 cDNA、基因组 DNA 或重组 DNA，或者 RNA，如 mRNA 或hnRNA。5.含有如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或如权利要求3所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系；所述表达盒包括启动柠檬烯环氧水解酶LEH 突变体编码基因转录的启动子，终止柠檬烯环氧水解酶LEH 突变体编码基因转录的终止子，任选地还包括增强子序列；所述重组载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质；所述重组微生物为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述的重组细胞系是植物细胞，动物细胞且不包括繁殖材料。6.含有如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或其编码基因在下述方面中的应用：A1）催化4
‑
(环氧乙烷
‑2‑
基)
‑1‑
丁醇生成 (S)
ꢀ‑ꢀ
(四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基)甲醇；A2）制备手性(四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基)甲醇；A3）催化2
‑
(3
‑
苯基氧杂环丁烷
‑3‑
基)乙醇合成(S)
ꢀ‑
(3
‑
苯基四氢呋喃
‑3‑
基)甲醇；A4）合成或制备手性(3
‑
取代四氢呋喃
‑3‑
基)甲醇；A5）催化N
‑
苄基
‑2‑
(3
‑
苯基氧杂环丁烷
‑3‑
基)乙胺合成(S)
ꢀ‑
(1
‑
苄基
‑3‑
苯基四氢吡啶
‑3‑
基)甲醇A6）合成或制备 (1
‑
苄基
‑3‑
芳基四氢吡啶
‑3‑
基)甲醇；A7）催化N
‑
苄基
‑2‑
(3
‑
苯基氧杂环丁烷
‑3‑
基)丙胺合成 (1
‑
苄基
‑3‑
苯基哌啶
‑3‑
基)甲醇A8）合成或制备(1
‑
苄基
‑3‑
取代基哌啶
‑3‑
基)甲醇。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述（四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基）醇可为如下任一种：(四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基)甲醇、1
‑
(四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基)乙
‑1‑
醇、 2
‑
(四氢
‑
2H
‑
吡喃
‑2‑
基)丙
‑2‑
醇；所述(3
‑
芳基四氢呋喃
‑3‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙周通，李军宽，曲戈，张武元，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：