稳定表达牛催乳素蛋白的乳腺上皮细胞的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达牛催乳素蛋白的乳腺上皮细胞的构建方法，该法主要利用Crispr/Cas9技术将牛催乳素基因和报告基因绿色荧光蛋白基因定点整合到小鼠β

【技术实现步骤摘要】
稳定表达牛催乳素蛋白的乳腺上皮细胞的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种稳定表达牛催乳素蛋白的乳腺上皮细胞的构建方法。

技术介绍

[0002]利用乳腺上皮细胞生产外源性功能蛋白是当前生命科学领域的研究热点。催乳素(Prolactin，PRL)是脊椎动物腺垂体细胞合成并分泌的一种肽类激素，在基因结构和功能上十分保守。PRL在动物的妊娠期和哺乳期发挥极其重要的作用，其主要功能是驱动乳腺和性腺发育，发动并维持泌乳，促进乳蛋白的合成与分泌。PRL还参与个体生殖生理的调控、应激反应、免疫活动及渗透压调节、神经，系统信号传递等，并对体细胞的增殖和分裂起直接作用等。在动物生产上，PRL基因是家畜生产性状的重要候选基因，有助于标记辅助选择的实施，并已成为提高反刍动物奶肉产量等研究的焦点。在人类医学方面，催乳素的研究主要集中在催乳素与乳腺增生、乳腺癌的关系与其在治疗方面的应用。
[0003]催乳素在动物生产和人类疾病治疗方面发挥重要作用。但商品化的纯催乳素主要从脑垂体组织中提取并纯化而来，工艺复杂，成本高，价格昂贵(价格超过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达牛催乳素蛋白的乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)选择小鼠β
‑
casein第二外显子上的sgRNA作为靶点，在其正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链分别添加Bbs I酶切位点粘性末端，经过变性、退火形成带有Bbs I酶切位点粘性末端的DNA双链；(2)将步骤(1)制得的双链与Bbs I酶切线性化的Cas9载体连接，得到重组切割表达载体Cas9
‑
sgRNA载体；(3)按“左同源臂
‑
外源基因
‑
右同源臂”的排列顺序，将靶序列切割位点两侧的同源臂片段与牛催乳素基因片段以及报告基因片段连接到线性化的载体骨架上得到Donor载体；(4)将Cas9
‑
sgRNA载体和Donor载体共转染到小鼠乳腺上皮细胞HC11中。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于还包括以下步骤：(5)对转染后的细胞进行筛选和检测，获得准确整合并能稳定表达牛催乳素和报告基因的阳性细胞克隆。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述sgRNA具有SEQ.ID.NO.1的碱基序列。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述外源基...

【专利技术属性】
技术研发人员：农微，谢体三，陈柏承，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：