一种pBG质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种pBG质粒载体，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。构建时，将基于商业化pCG载体使用的启动GS基因表达的SV40promoter替换为HSV TK promoter后，有利于降低筛选压力缩短细胞株开发过程中的时间；将hCMV promoter替换为mCMVpromoter大幅度提高了目的蛋白的表达量；在重链和轻链下游分别使用bGH poly(A)和hGH poly(A)维持目的基因的稳定性从而获得高表达目的蛋白；将轻链基因放在GS表达框的下游，轻链基因下游使用Gastrin Terminator终止轻链基因表达，使抗体轻链和重链按照一定的比例表达从而提高目的基因表达量。本发明专利技术提供的pBG载体中目的基因的表达量是在商业化pCG载体中的表达量的2

【技术实现步骤摘要】
一种pBG质粒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种pBG质粒载体及其应用。

技术介绍

[0002]生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始，将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内。常见的转染方式主要有磷酸钙转染、电穿孔转染、脂质体转染和逆转录病毒转染。DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组中，因此其表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。然后，不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞池。由于此时得到的细胞池中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料(fed
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batch)实验，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等因素，选出最优的几个克隆进入生物反应器放大实验，最终确定生产用单克隆细胞株。
[0003]目前常用的CHO细胞尚存在一些缺陷，比如：较长的稳定细胞株构建周期(4+月)；较低的产量(<10g/L)，造成单位生产成本较高；较长的细胞倍增时间(20+小时)；多种宿主蛋白对下游纯化造成压力；遗传学的不稳定性，造成细胞表达量随着培养时间的延长而降低；克隆内部的异质性；蛋白质量(PQAs)的异质性等。
[0004]这些问题的解决大多需要细胞工程学研究来解决。如通过鉴定细胞基因组中的“热点”区域，并通过定点整合技术将目标基因定点整合到基因组中，进一步缩短细胞株构建周期；通过优化细胞代谢通路，提升代谢效率，提升细胞倍增速率；产量的进一步提升可以通过表达一些蛋白折叠辅助蛋白等来实现；敲除对细胞生长和蛋白分泌不相关的一些蛋白基因，可降低宿主细胞压力，同时减少宿主蛋白对下游纯化的干扰；蛋白翻译后修饰在大分子药效药代过程中扮演着重要的角色，通过基因工程可以修改这些修饰相关酶的表达量，来调控翻译后修饰。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种pBG质粒载体，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]具体的，pBG质粒载体依次包括：Ori:复制起始点；Amp terminator：氨苄青霉素终止子；AmpR：氨苄青霉素抗性基因；AmpR promoter：氨苄青霉素抗性基因启动子；T7Te terminator：T7Te终止子；HSV TK promoter：HSV TK启动子；GS cDNA：谷氨酰胺合成酶基因；small t intron：小t内含子；SV40 NLS：SV40核定位信号；SV40 poly(A)signal：SV40 poly(A)；mCMV promoter：鼠源的CMV启动子；L MCS：轻链的多克隆位点；H MCS：重链的多克隆位点；hGH poly(A):人生长激素poly(A)；gastrin terminator：胃泌素终止子；bGH poly(A)：牛生长激素poly(A)。
[0007]具体的，所述HSV TK promoter序列如SEQ ID NO.11所示，启动GS基因表达。为了缩短筛选时间，本专利技术将已经商业化的pCG载体使用的启动GS基因表达的SV40 promoter，替换为弱启动子HSV TK promoter后，有利于降低筛选压力，缩短细胞株开发过程中的时间。
[0008]具体的，所述mCMV promoter序列如SEQ ID NO.12所示，启动目的基因表达。为了提高目的基因的表达量，本专利技术将pCG载体使用的hCMV启动子替换为mCMV启动子大幅度提高了目的基因的表达量。
[0009]具体的，所述bGH poly(A)序列如SEQ ID NO.13所示，在重链维持目的基因的稳定性。
[0010]具体的，所述hGH poly(A)序列如SEQ ID NO.14所示，在轻链维持目的基因的稳定性。为了维护mRNA的稳定从而获得高表达目的蛋白，本专利技术在重链和轻链下游分别使用bGH poly(A)和hGH poly(A)维持目的基因mRNA的稳定性，从而获得高表达目的蛋白。
[0011]具体的，所述Gastrin Terminator序列如SEQ ID NO.15所示，终止轻链基因表达。
[0012]具体的，所述pBG质粒载体的轻链基因表达框紧邻GS表达框。为了使抗体轻链和重链按照一定的比例表达从而提高目的基因表达量，本专利技术将轻链基因放在GS表达框的下游，轻链基因下游使用Gastrin Terminator终止轻链基因表达，这样有利于促进轻链和重链单独转录为mRNA。轻链基因的表达框紧邻GS基因表达框，有利于促进轻链基因的表达，实现轻链基因和重链基因能够分别表达，并且轻链能表达过量的目标产物。为了提高转染效率，本专利技术的载体去除了较多的不利于在CHO细胞中的基因整合和稳定表达的无效序列。
[0013]本专利技术还提供一种将外源重链和轻链基因转入权利要求1所述的pBG质粒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014](1)重链基因使用Xba I和Nde I双酶切，酶切后的目的片段构建到Xba I和Nde I双酶切的所述pBG中，形成载体pBG
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H，热激转化到感受态后，挑选单菌落，经PCR、酶切和测序验证后，用于终载体的构建；
[0015](2)轻链基因使用BamH I和Hind III双酶切，酶切后的目的片段构建到BamH I和Hind III双酶切的所述载体pBG
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H中，形成终载体pBG
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HL；热激转化到感受态后，挑选单菌落，使用PCR、酶切和测序三种方法进行验证。
[0016]本专利技术还提供一种转化体，其含有权利要求1所述的pBG质粒载体。
[0017]本专利技术还提供一种权利要求1所述的pBG质粒载体在单克隆细胞株中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果是目的蛋白在pBG载体中的表达量是在pCG载体中的表达量的2
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3倍。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面对本专利技术所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1是pBG载体质粒图谱。其依次包括：Ori:复制起始点；Amp terminator：氨苄青霉素终止子；AmpR：氨苄青霉素抗性基因；AmpR promoter：氨苄青霉素抗性基因启动子；T7Te terminator：T7Te终止子；HSV TK promoter：HSV TK启动子；GS cDNA：谷氨酰胺合成
酶基因；small t intron：小t内含子；SV40 NLS：SV40核定位信号；SV40 poly(A)signal：SV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pBG质粒载体，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的pBG质粒载体，其特征在于，其依次包括：Ori:复制起始点；Amp terminator：氨苄青霉素终止子；AmpR：氨苄青霉素抗性基因；AmpR promoter：氨苄青霉素抗性基因启动子；T7Te terminator：T7Te终止子；HSV TK promoter：HSV TK启动子；GS cDNA：谷氨酰胺合成酶基因；small t intron：小t内含子；SV40 NLS：SV40核定位信号；SV40 poly(A)signal：SV40 poly(A)；mCMV promoter：鼠源的CMV启动子；L MCS：轻链的多克隆位点；H MCS：重链的多克隆位点；hGH poly(A):人生长激素poly(A)；gastrin terminator：胃泌素终止子；bGH poly(A)：牛生长激素poly(A)。3.根据权利要求2所述的pBG质粒载体，其特征在于：所述HSV TK promoter序列如SEQ ID NO.11所示，启动GS基因表达。4.根据权利要求2所述的pBG质粒载体，其特征在于：所述mCMV promoter序列如SEQ ID NO.12所示，启动目的基因表达。5.根据权利要求2所述的pBG质粒载体，其特征在于：所述bGH poly(A)序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦鹏，房磊，项涛，陈骍程，徐琦，
申请(专利权)人：上海碧博生物医药工程有限公司，
类型：发明
国别省市：