组装双组分病毒样颗粒的方法技术

公开了制备纳米结构的方法的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将组分A(compA)蛋白添加到包括组分B(compB)蛋白的溶液中，从而形成compA:compB复合物。进一步公开了制备纳米结构的方法，所述方法包括(i)提供包括第一蛋白质的第一入口流体流和包括第二蛋白质的第二入口流体流，以及(ii)使所述第一入口流体流与所述第二入口流体流接触以形成出口流，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合发生在所述出口流中，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的蛋白质复合物。可以使用微流体混合器。所述方法可以进一步包括通过用1,000kDa膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的compA、过量的compB和/或其它杂质中纯化所述compA:compB复合物。中纯化所述compA:compB复合物。中纯化所述compA:compB复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组装双组分病毒样颗粒的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年6月9日提交的美国临时申请第63/036,505号的优先权，所述美国临时专利申请的全部内容特此通过引用并入。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸质副本，并在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是ICVX_009_01WO_ST25.txt。所述文本文件为838KB，创建于2021年6月9日并且通过EFS
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Web以电子方式提交。


[0005]本公开一般涉及自组装蛋白质纳米结构，特别是制备纳米结构的方法，包含基于纳米结构的疫苗。

技术介绍

[0006]基于蛋白质的病毒样颗粒(pbVLP)(也称为纳米结构)为对称呈现蛋白质或其它大分子提供了有用的平台。其可以与由病毒衣壳蛋白(例如，来自无包膜病毒)或脂质包埋蛋白(例如，从包膜病毒提取或使用与脂质混合的重组膜蛋白制备)制成的常规VLP区分开来。后者通常没有定义的对称性。由于在病毒衣壳上附着蛋白质的挑战，前者通常在其显示蛋白质的能力方面受到限制。
[0007]VLP的一种应用(尤其是对于pbVLP)通常是作为疫苗。研究实验表明，与常规亚单位疫苗和非对称VLP相比，pbVLP上显示的抗原引发更强的抗体应答。
[0008]Bale等人,《科学(Science)》353:389
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394(2016)公开了各种双组分二十面体pbVLP，包含一组由指定为组分A(compA)和组分B(compB)的蛋白质组分制成的pbVLP。
[0009]本领域仍然需要表达、纯化和组装基于蛋白质的病毒样颗粒的方法。本公开满足了此需要。

技术实现思路

[0010]本专利技术一般涉及组装和纯化pbVLP的方法。
[0011]本文提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将组分A(compA)蛋白添加到包括组分B(compB)蛋白的溶液中，从而形成compA:compB复合物。在一些实施例中，所述compA:compB复合物是具有二十面体对称性的复合物。在一些实施例中，所述compA:compB复合物是pbVLP。
[0012]在一些实施例中，本公开提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将融合蛋白添加到包括组分B(compB)蛋白的溶液中，其中所述融合蛋白包括与抗原蛋白连接的compA蛋白，从而形成compA:compB复合物。
[0013]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在所述溶液的表面之下将所述compA蛋白添加到所述compB蛋白中。
[0014]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有机械混合的情况下混合所述溶液。
[0015]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有搅拌棒的情况下混合所述溶液。
[0016]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括在没有叶轮的情况下混合所述溶液。
[0017]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括使用轨道搅拌混合所述溶液。
[0018]在一些实施例中，使剪切应力最小化的所述条件包括使用微流体混合器混合所述溶液。在一些实施例中，所述微流体混合器是Ignite
TM
筒或其任何等效物。
[0019]在一些实施例中，所述方法包括将过量的所述compA蛋白添加到所述compB蛋白中。在一些实施例中，所述方法包括将所述compA蛋白添加到所述compB蛋白中，其中所述compA蛋白的摩尔浓度与所述compB蛋白的摩尔浓度基本相等。
[0020]在一些实施例中，所述方法提供在没有明显沉淀的情况下的compA和compB的混合。在一些实施例中，相对于compA和compB的溶液的机械混合，所述方法提供在没有明显沉淀的情况下的compA和compB的混合。
[0021]在一些实施例中，所述方法提供了所述compA:compB复合物的形成，其量为总蛋白质的至少约40％，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。在一些实施例中，所述方法提供了所述compA:compB复合物的形成，其量为总蛋白质的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％或约95％，例如，如通过尺寸排阻色谱法测量的。
[0022]在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用1,000kDa膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的compA、过量的compB和/或其它杂质中纯化所述compA:compB复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过用具有约300kDa至3,000kDa孔径的亲水性膜过滤所述溶液来从过量的compA、过量的compB和/或其它杂质中纯化所述compA:compB复合物。在一些实施例中，所述孔径为约800kDa、约900kDa，约1000kDa、约1100kDa、约1200kDa、约1300kDa、约1400kDa或约1500kDa。在一些实施例中，所述亲水性膜包括选自以下的材料：PVD纤维素、复合再生纤维素(CRC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、尼龙和聚醚砜。
[0023]在一些实施例中，所述1,000kDa膜是复合再生纤维素(CRC)膜。
[0024]在一些实施例中，所述1,000kDa膜是1000kDa膜或其等效物。
[0025]在一些实施例中，所述过滤包括切向流过滤(TFF)。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％或更高的所述compA:compB复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的所述compA:compB复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。在一些实施例中，所述过滤提供纯度为约90％至99％的所述compA:compB复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。
[0026]在一些实施例中，所述方法不包括用疏水性膜(例如，Pellicon Biomax 1000kDa)、丁基对流相互作用介质(CIM)柱、Captocore700柱或其等效物纯化所述溶液。
[0027]在一些实施例中，所述方法是连续或半连续过程。
[0028]在一些实施例中，在所述添加步骤之前连续产生所述compA蛋白。
[0029]在一些实施例中，所述compB蛋白作为一个或多个冷冻批次提供。
[0030]在一些方面，本公开提供了一种制备纳米结构的方法，所述方法包括(i)提供包括第一蛋白质的第一入口流体流和包括第二蛋白质的第二入口流体流，以及(ii)使所述第一入口流体流与所述第二入口流体流接触以形成出口流，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合发生在所述出口流中，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的蛋白质复合物。在一些实施例中，所述方法包括(i本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备纳米结构的方法，所述方法包括在使剪切应力最小化的条件下将组分A(compA)蛋白添加到包括组分B(compB)蛋白的溶液中，从而形成compA:compB复合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括在所述溶液的表面之下将所述compA蛋白添加到所述compB蛋白中。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括在没有机械混合的情况下混合所述溶液。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括在没有搅拌棒的情况下混合所述溶液。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括在没有叶轮的情况下混合所述溶液。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括使用轨道搅拌混合所述溶液。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使剪切应力最小化的所述条件包括使用微流体混合器混合所述溶液。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括将过量的所述compA蛋白添加到所述compB蛋白中。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中任选地相对于compA和compB的溶液的机械混合，所述条件提供在没有明显沉淀的情况下的compA和compB的混合。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述compA:compB复合物以总蛋白质的至少约40％的量形成，任选地如通过尺寸排阻色谱法测量的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过用1,000kDa膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的compA、过量的compB和/或其它杂质中纯化所述compA:compB复合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述1,000kDa膜是复合再生纤维素(CRC)膜。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述1,000kDa膜是1000kDa膜或其等效物。14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述过滤包括切向流过滤(TFF)。15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述纯化提供纯度为约80％或更高的所述compA:compB复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法不包括用疏水性膜(例如，Pellicon Biomax 1000kDa)、丁基对流相互作用介质(CIM)柱、Captocore700柱或其等效物纯化所述溶液。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法是连续或半连续过程。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤之前连续产生所述compA蛋白。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述compB蛋白作为一个或多个冷冻批次提供。20.一种制备纳米结构的方法，所述方法包括(i)提供包括第一蛋白质的第一入口流体流和包括第二蛋白质的第二入口流体流，以及(ii)使所述第一入口流体流与所述第二入口
流体流接触以形成出口流，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合发生在所述出口流中，从而形成包括所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的蛋白质复合物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一入口流体流和所述第二入口流体流以三通配置连接以形成所述出口流，任选地其中所述三通配置是T形或Y形配置。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中使用微流体混合器将所述第一入口流体流和所述第二入口流体流连接以形成所述出口流，任选地其中所述微流体混合器是Ignite
TM
筒或其任何等效物。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述微流体混合器包括一个或多个被动混合元件以促进所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的混合。24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述出口流包括的所述第一蛋白质的摩尔浓度超过所述第二蛋白质的摩尔浓度。25.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述出口流包括的所述第一蛋白质的摩尔浓度基本上等于所述第二蛋白质的摩尔浓度。26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的所述混合在没有所述第一蛋白质、所述第二蛋白质、所述复合物或其组合的明显沉淀的情况下发生。27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述复合物以总蛋白质的至少约40％的量形成，任选地如通过尺寸排阻色谱法测量的。28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过用1,000kDa膜或其等效物过滤所述溶液来从过量的第二蛋白质和/或其它杂质中纯化所述复合物。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述1,000kDa膜是复合再生纤维素(CRC)膜。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述1,000kDa膜是1000kDa膜或其等效物。31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述过滤包括切向流过滤(TFF)。32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述纯化提供纯度为约90％或更高的所述复合物，如通过占总蛋白质的重量百分比测量的。33.根据权利要求20至32中任一项所述的方法，其中所述方法不包括用疏水性膜(例如，Pellicon Biomax 1000kDa)、丁基对流相互作用介质(CIM)柱、Captocore700柱或其等效物纯化所述溶液。34.根据权利要求20至33中任一项所述的方法，其中所述方法是连续或半连续过程。35.根据权利要求20至34中任一项所述的方法，其中在所述添加步骤之前连续产生所述第一蛋白质。36.根据权利要求20至35中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白质作为一个或多个冷冻批次提供。37.根据权利要求20至36中任一项所述的方法，其中所述第一组分是组分A(compA)和/或所述第一组分是组分B(compB)。38.根据权利要求1至19或37中任一项所述的方法，其中所述compA包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：SEQ IN NO:1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、29
‑
31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59。39.根据权利要求1至19或37至38中任一项所述的方法，其中所述compB包括与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：SEQ IN NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、27、28、32
‑
34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58。40.根据权利要求1至19或37中任一项所述的方法，其中所述compA和所述compB各自包括分别与以下中的任一个具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽序列：(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；(iii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:24；(iv)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:4；(v)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；(vi)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(vii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27；(viii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28；(ix)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:6；(x)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；(xi)SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：Icosavax股份有限公司，
类型：发明
国别省市：