一种防治致病疫霉的多元纳米制剂及其制备方法技术

本申请提供了一种多元纳米制剂，其为纤维二糖、SPc和dsRNA的多元纳米制剂。本申请的多元纳米制剂中，SPc可有效保护dsRNA免受RNase A降解并且提高致病疫霉孢子和马铃薯叶片对dsRNA的吸收效率，同时SPc与纤维二糖通过疏水作用结合形成络合物；本申请的多元纳米制剂在马铃薯晚疫病发生田块具有显著的防治效果，优于商品化药剂代森锰锌的防控效果。于商品化药剂代森锰锌的防控效果。于商品化药剂代森锰锌的防控效果。

【技术实现步骤摘要】
一种防治致病疫霉的多元纳米制剂及其制备方法


[0001]本申请属于生物农药
，具体地，一种防治致病疫霉的多元纳米制剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是马铃薯(Solanum tuberosum)上的一种全球毁灭性病害。2020年马铃薯晚疫病被农业农村部列为我国一类农作物病害。目前，防治该病害的方法主要依赖杀菌剂喷施、植物的遗传抗性以及转基因技术。其中化学杀菌剂在防病方面最为快速高效，但农药的不科学使用导致病原菌抗药性逐年加重、土壤污染严重，急需开发新型绿色防控技术。
[0003]RNA农药是通过体外制备的能够诱发病原菌和昆虫关键存活基因沉默从而达到防治目标的一种新型农药产品，由此提出了发展喷洒诱导基因沉默(Spray
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induced Gene Silencing，SIGS)技术，即体外生产靶向病原物关键基因的dsRNA(Double
‑
stranded RNA)或siRNA(Small interfering RNA)，通过外源喷洒的方法诱导病原物靶标基因沉默。但利用该方法防治致病疫霉相较真菌而言更为困难，原因在于致病疫霉吸收环境RNA困难，植物细胞壁等物理屏障限制了dsRNA进入病原或植物细胞的数量，限制了RNAi效果。除此之外，RNA农药存在易发生变性降解的问题，即dsRNA喷洒后可能被环境中的RNA酶、紫外线辐射等变性或降解，造成了dsRNA持效期较短等瓶颈问题。
专利技术内容
[0004]申请人团队前期研发了一系列药剂型纳米载体SPc，通过分子间互作实现纳米级药物装载，大幅提升进入活体细胞的递送效率，初步具有提升防治效率、降低农药使用量、扩大防治谱的作用，为农药的有效利用提供了新的技术途径。纤维二糖作为一种植物诱抗剂，可诱导和增强植物免疫，提升植物对病原菌的抵抗力。本研究针对致病疫霉的两个关键毒力基因PiHmp1及PiCut3设计双靶点dsRNA，将纳米载体SPc同时装载dsRNA和纤维二糖形成SPc/dsRNA/纤维二糖多元纳米制剂，测试了SPc对dsRNA进入致病疫霉及马铃薯叶片的提升效果以及多元纳米制剂的防控效果，为田间马铃薯晚疫病的生物防控技术提供新思路。
[0005]一方面，本申请提供了一种多元纳米制剂，所述多元纳米制剂为纤维二糖、SPc和dsRNA的多元纳米制剂。
[0006]进一步地，所述dsRNA为dsPihmp1+PiCut3。
[0007]进一步地，所述dsPihmp1+PiCut3序列为SEQ ID NO.1。
[0008]另一方面，本申请提供了上述多元纳米制剂的制备方法，所述方法包括：将纤维二糖与SPc混合后孵育得到纤维二糖/SPc复合物的步骤将纤维二糖/SPc复合物与dsRNA溶液混合。
[0009]进一步地，所述制备方法中纤维二糖与SPc混合的质量比为1:1。
[0010]进一步地，所述制备方法中纤维二糖/SPc复合物与dsRNA溶液混合的质量比为1:
1。
[0011]进一步地，所述制备方法为：
[0012]将纤维二糖溶于无菌水中；纤维二糖与SPc按1:1的质量比混合；混合物在室温下孵育15分钟，然后用分子量为1000Da的再生纤维素袋透析12小时，得到纤维二糖/SPc复合物；
[0013]将纤维二糖/SPc复合物与dsRNA溶液按照1：1的质量比混合，震荡使两种溶液充分接触，室温静置15min后得到多元纳米制剂。
[0014]另一方面，本申请提供了上述多元纳米制剂在制备防治致病疫霉的农药中的应用。
[0015]另一方面，本申请提供了上述多元纳米制剂在制备防治马铃薯晚疫病的农药中的应用。
[0016]本申请中所述的SPc结构如图1所示，其制备方法按照Jianhao Li等，AFacile
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Synthesized Star Polycation Constructed as a Highly Efficient Gene Vector in Pest Management，ACS Sustainable Chem.Eng，2019,7,6316
‑
6322进行。
附图说明
[0017]图1为SPc结构式；
[0018]图2显示SPc对dsRNA的保护作用结果；
[0019]图3显示SPc促进致病疫霉孢子及马铃薯对dsRNA的吸收；
[0020]图4显示dsRNA/SPc复合体对马铃薯离体叶片的保护作用；
[0021]图5显示多元纳米制剂的结合作用力结果；
[0022]图6显示多元纳米制剂的粒径及形貌观测结果；
[0023]图7显示多元纳米制剂田间防效检测结果。
具体实施方式
[0024]以下实施例便于更好地理解本专利技术，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。
[0025]dsPihmp1+PiCut3的制备：通过OverlapPCR及同源重组的方法将筛选得到的两个抑菌效果较好的致病疫霉菌靶标基因PiHmp1和PiCut3串联在PET
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28a(+)载体上，转化进团队前期改造的可高效表达dsRNA的工程菌株BL21(DE3)RNasellI中，通过体外合成发夹RNA:dsPihmp1+PiCut3，粗提RNA后纯化后备用。dsRNA序列为GGCACGAATGGGTAGCATGTGACCAAGAAGGAGAAGGCTCTCGAATACTCGAATATGGGTCTTTTCGTGCTGTCCATGTTCGATCCGACGGGTATTGCCTGGATGGCTTCCGAGTTCGTGCAGCCCATTTGTGGACCCACTGAGTACCTGGGTGAGATCGATGATGGTACGCTGTACGACGCTCTGGGTCTAAACACGGTCGACCAGGCGTTCCTGGGAAGCTACGGTGTGTGGAAGAAGAAGGGTGATGGAGAGTCGATCGGTATTCGTGCTTGGAGGGTACTCACAAGGCGCTAGTGTCACCGATATCTCGCTTGGCATCAAGACCATGCTTGGCACAGGTGAATCCATCCCAGAAACCCTGGCACCGCGCATCAAAGCTGTGGTAACGTTCGGCAATCCGCTTAAGCTCATGGGCCAGACCATTGAAAGCTCCAGCTCGACTTACGGCTCTAAGGCCATTGGCTTCTGCAACAGA(SEQ ID NO.1)。
[0026]GGCACGAATGGGTAGCATGTGACCAAGAAGGAGAAGGCTCTCGAATACTCGAATATGGGTCTTTTCGT
GCTGTCCATGTTCGATCCGACGGGTATTGCCTGGATGGCTTCCGAGTTCGTGCAGCCCATTTGTGGACC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多元纳米制剂，其特征在于，所述多元纳米制剂为纤维二糖、SPc和dsRNA的多元纳米制剂。2.根据权利要求1所述的多元纳米制剂，其中所述dsRNA为dsPihmp1+PiCut3。3.根据权利要求2所述的多元纳米制剂，其中所述dsPihmp1+PiCut3序列为SEQ ID NO.1。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的多元纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将纤维二糖与SPc混合后孵育得到纤维二糖/SPc复合物的步骤将纤维二糖/SPc复合物与dsRNA溶液混合。5.根据权利要求4所述的制备方法，其中所述制备方法中纤维二糖与SPc混合的质量比为1:1。6.根据权利要求4所述的制备方法，其中所述制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓丹，闫硕，沈杰，徐光远，王玉玺，李名珊，应佳汗，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：