用于检测CP4-EPSPS的胶体金免疫层析试纸制造技术

本发明专利技术公开了用于检测CP4

【技术实现步骤摘要】
用于检测CP4
‑
EPSPS的胶体金免疫层析试纸


[0001]本专利技术属于检测领域，具体涉及用于检测CP4
‑
EPSPS的胶体金免疫层析试纸。

技术介绍

[0002]目前，全球种植转基因农作物的面积一直快速增长，在大豆中植入CP4
‑
EPSPS基因，可以有效提高大豆抗草甘膦除草剂的抗性。
[0003]目前对于检测转基因成分CP4
‑
EPSPS的检测方法主要基于核酸的PCR、LAMP等检测方法为主，这些方法虽然具有准确性好、灵敏度高等优点，但设备昂贵，且操作人员需要进行专业的培训，不能够满足现场快速检测的需求，难以在企业及作物种植现场进行检测。而免疫层析检测方法成本低廉、操作简便、特别适用于现场初步筛查判断、与仪器检测方法相得益彰。
[0004]然而现有的胶体金免疫层析方法，灵敏度相对较差，检测结果的可靠性相对较低，难以满足需要。如何优化反应条件，制备得到的灵敏度更佳的CP4
‑
EPSPS胶体金免疫层析试纸，对于得到高质量的CP4
‑
EPSPS胶体金免疫层析检测试纸具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供用于检测CP4
‑
EPSPS的胶体金免疫层析试纸。
[0006]本专利技术所采取的技术方案是：
[0007]用于检测CP4
‑
EPSPS的胶体金免疫层析试纸，所述胶体金免疫层析试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和底板，所述结合垫上吸附固定有CP4
‑
EPSPS金标抗体，所述硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述检测线固定有CP4
‑
EPSPS包被抗体，
[0008]其中：
[0009]CP4
‑
EPSPS金标抗体的制备方法包括：
[0010]在离心管内加入胶体金溶液，使用0.1M的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH，胶体金溶液与K2CO3溶液的体积比为1mL：(5～7)μL，混匀，得到标记液；
[0011]在标记液中加入CP4
‑
EPSPS标记抗体，混匀后20～30℃反应3～7min；
[0012]反应完毕后，加入BSA，封闭；
[0013]封闭完成后，离心使胶体金标记的抗体沉淀，弃去上清，加入重悬液，超声混匀，得到CP4
‑
EPSPS金标抗体溶液；
[0014]CP4
‑
EPSPS包被抗体的包被液组成为：PBS+1.8～2.2wt％蔗糖+0.01％～0.03wt％NaN3。
[0015]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述胶体金溶液中，胶体金的浓度为(2～3)
×
10
‑4g/mL。
[0016]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，胶体金溶液与K2CO3溶液的体积比为1mL：6μL。
[0017]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述重悬液的pH为7.7～8，优选为7.8。
[0018]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述重悬液500mL的组成为：
[0019]0.2mol/L PBS：20mL
[0020]BSA：2.5g
[0021]10％ Tween
‑
20：25mL
[0022]蔗糖：25g
[0023]蒸馏水：435mL
[0024]pH＝7.8。
[0025]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述CP4
‑
EPSPS标记抗体与所述标记液的混合比为(0.4～0.6)μg/1mL。
[0026]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述包被液中，PBS的浓度为0.15～0.3M，优选0.2M。
[0027]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，封闭完成后，10000rpm，7℃离心10min后，弃去上清，加入600μL胶体金探针重悬液，超声混匀，得到CP4
‑
EPSPS金标抗体溶液。
[0028]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，所述样本垫吸附有酪蛋白。
[0029]在一些胶体金免疫层析试纸的实例中，CP4
‑
EPSPS包被抗体和包被液混合比为：(0.8～1.2)μg/200μL，优选为1.0μg/200μL。
[0030]本专利技术的有益效果是：
[0031]本专利技术的用于检测CP4
‑
EPSPS的胶体金免疫层析试纸，具有相对更佳的灵敏度和稳定性，整体性能优于现有的进口同类产品。通过肉眼观察确定cut
‑
off值，T线在5ng/mL时完全消失，因此在缓冲液体系下的vLOD值为5ng/mL，对CP4
‑
EPSPS的特异性好。在4℃条件下，低温储藏15d后，该试纸条的T线和C线的显色强度基本不变，说明该试纸条抗低温能力强，可用于低温储存。在45℃高温条件下存放30天后，该试纸条的T线和C线显色略有降低，但其检测限变化不大，表明试纸条具有良好的稳定性。
附图说明
[0032]图1是胶体金溶液的照片。
[0033]图2是胶体金的紫外
‑
可见光吸收光谱图。
[0034]图3是胶体金透射电子显微镜扫描图。
[0035]图4是不同标记、包被抗体对试纸条的影响，a:阳性结果b:阴性结果。
[0036]图5是K2CO3添加量对试纸条的影响；a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0037]图6是抗体添加量对试纸条的影响；a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0038]图7是胶体金与抗体偶连前后紫外
‑
可见吸收光谱。
[0039]图8是包被抗体的添加量对试纸条的影响，a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0040]图9是样品垫处理液对试纸条的影响，a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0041]图10是AuNPs
‑
LFIA检测黄豆中CP4
‑
EPSPS的vLOD值；a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0042]图11是AuNPs
‑
LFIA特异性测试结果，a:裸眼观察；b:T线光密度柱状图。
[0043]图12是低温性实验a:裸眼观察b:T线光密度柱状图。
[0044]图13是加速稳定性实验a:裸眼观察b:T线光密度柱状图。
[0045]图14是本专利技术试纸与进口试纸条对比实验，a:裸眼观察b:T线光密度柱状图。
具体实施方式
[0046]下面结合实验，进一步说明本专利技术的技术方案。
[0047]方便比较起见，本专利技术使用的缓冲液和标准溶液如下：
[0048](1)2％氯金酸水溶液：100mL
[0049]氯金酸
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测CP4
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EPSPS的胶体金免疫层析试纸，所述胶体金免疫层析试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和底板，所述结合垫上吸附固定有CP4
‑
EPSPS金标抗体，所述硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述检测线固定有CP4
‑
EPSPS包被抗体，其特征在于，其中：CP4
‑
EPSPS金标抗体的制备方法包括：在离心管内加入胶体金溶液，使用0.1 M 的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH，胶体金溶液与K2CO3溶液的体积比为1 mL：(5～7)μL，混匀，得到标记液；在标记液中加入CP4
‑
EPSPS标记抗体，混匀后20～30℃反应 3～7 min；反应完毕后，加入BSA，封闭；封闭完成后，离心使胶体金标记的抗体沉淀，弃去上清，加入重悬液，超声混匀，得到CP4
‑
EPSPS金标抗体溶液；CP4
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EPSPS包被抗体的包被液组成为：PBS+1.8～2.2 wt%蔗糖+0.01%～0.03wt% NaN3。2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液中，胶体金的浓度为(2～3)
×
10
‑
4 g/mL。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：