一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途。该效应细胞的构建是通过在Jurkat细胞中，对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将两个报告基因GFP和luciferase定点敲入Nur77基因的编码框后，以保证报告基因的表达调控同内源性Nur77基因的表达一致。该效应细胞可通过Nur77信号强弱来反应和评估CAR和TCR分子的特异性功能，包括抗原依赖信号和非抗原依赖Tonic信号的强弱。本发明专利技术方法高效、经济、便捷且结果稳定准确。便捷且结果稳定准确。便捷且结果稳定准确。

【技术实现步骤摘要】
一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途


[0001]本专利技术涉及一种效应细胞及其构建方法和用途，具体涉及一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途。

技术介绍

[0002]肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。近几年，随着CAR
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T和TCR
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T技术的发展，使得肿瘤免疫治疗焕发新春，并进入大爆发阶段。其中，CAR
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T已经在血液肿瘤上显示出治愈肿瘤的潜力。嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞是当前过继性细胞治疗技术中最新和最富有成效的技术，实现了从基础免疫学机制研究到临床肿瘤免疫治疗应用的转变。因其能够表达人工合成受体并能特异性识别靶细胞，CAR
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T和TCR
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T正成为振奋人心的肿瘤治疗方法。
[0003]CAR和TCR特异性分子序列设计和筛选，以及结构优化和评价是目前各大公司和学术结构在开发CAR
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T和TCR
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T产品中所面临的最关键问题。比如，目前传统筛选方法以高亲和力为指标选择CAR分子，无法区分肿瘤细胞和正常细胞。在临床中，肿瘤特异性不高的CAR
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T细胞在杀伤癌细胞的同时会攻击正常细胞，从而对患者正常生理功能产生副作用。此外，CAR除了特异性识别肿瘤靶抗原以激活T细胞发挥杀伤功能，其本身CAR分子在T细胞表面的表达密度，折叠构象，以及共刺激因子等结构特性都可能会激活T细胞的非抗原依赖的信号，被称为Tonic信号。当这种Tonic信号过强时，在没有靶抗原刺激下，该信号便可过度激活T细胞，诱导T细胞分化，加速T细胞耗竭，从而减少CAR
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T在体内的存续性，进而影响其抗肿瘤功能。因此，开发同时能够评价CAR以及TCR分子亲和性、特异性和Tonic信号的高效甚至高通量的评估体系，是推动CAR
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T和TCR
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T疗法进一步拓展的关键步骤。
[0004]Jurkat细胞是人白血病T淋巴细胞，具有原代T淋巴细胞的相应特点与功能，表面表达CD3等抗原，通过基因工程改造可成为用于CD3双抗以及CAR或TCR分子特异性评估的效应细胞。目前常用的如Jurkat
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NFAT
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LUC细胞，该效应细胞构建的原理是基于TCR/CD3复合物或CAR分子被靶向刺激后导致细胞内PLC
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γ的磷酸化和活化，进而激活NFAT通路的转录，从而使NFAT
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RE介导的荧光产生，最终利用荧光信号的强弱来反应抗体或CAR分子的特异性。与NFAT相类似的还有如基于41
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BB或CD69信号通路构建的Jurkat效应细胞，但是这些基因的表达调控不仅通过直接的抗原刺激而被激活，而且还被其他炎症介质(例如I型干扰素和白介素)间接激活。因此，并不是很合适用于Tonic信号的评估。Nur77(NR4A1)作为核受体家族转录因子，它的表达可作为淋巴细胞抗原特异性激活的分子标志物，已经在人胸腺组织和基因报告小鼠中得到证实，同时在小鼠模型中也证明它对I型干扰素或细胞因子刺激没有反应。
[0005]因此，本专利技术提供了一种基于Nur77信号通路的基因工程改造的Jurkat效应细胞的构建方法以及该效应细胞的具体用途，对CAR或者TCR分子的功能评估具有重大意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决传统的Jurkat效应细胞面临的无法同时高效精准的检测CAR以及TCR分子亲和性、抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的Tonic信号等问题。通过基因编辑的策略，构建一种基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞，可同时高效精准并且快捷方便的评估CAR或TCR分子的抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的Tonic信号。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种构建Jurkat效应细胞的方法，包括以下具体步骤：
[0008]通过在Jurkat细胞中对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将报告基因定点并同框敲入Nur77基因的编码框，以保证报告基因的表达调控同内源性Nur77基因的表达一致。
[0009]较佳的，将基因编辑物质递送至Jurkat细胞所使用的基因编辑方法可以是ZFN、TALEN或/和CRISPR
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Cas9等；优选CRISPR
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Cas9，Cas9可以为SpCas9、SaCas9、SpCas9
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HF、eSpCas9、xCas9、cpf1或其它不同菌属的Cas9；更优选SpCas9。
[0010]较佳的，基因编辑物质可以是质粒、病毒、DNA、mRNA或/和RNA蛋白复合体；优选RNA蛋白复合体或/和同源修复的模板dsDNA。
[0011]较佳的，基因编辑物质的递送可以使用脂质体、磷酸钙、DEAE
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葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法；优选电穿孔转染。
[0012]在一些实施方案中，CRISPR
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Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA、Cas9蛋白或/和sgRNA。优选使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。RNP复合体可以通过直接混合温育Cas9蛋白和sgRNA获得，或者通过将二者混合于特定缓冲液(诸如电转缓冲液)中获得。
[0013]在一些实施方案中，sgRNA的设计是首先明确敲入的基因组位点，利用该位点周围的DNA序列设计的。设计的原则是PAM区序列为NGG，其中N为A、T、C和G中的任一碱基。sgRNA包括靶向的crRNA序列和tracrRNA序列，其中crRNA可以是17、18、19、20、21或22个碱基，优选20个碱基。
[0014]在一些实施方案中，sgRNA是未经修饰的或化学修饰的。化学修饰包括2
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O
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甲基化、3
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硫代、2
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O
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甲基化结合3
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硫代等。
[0015]在一些实施方案中，5
’
和3
’
端3个碱基同时进行2
‑
O
‑
甲基化和3
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硫代修饰。化学修饰可以发生在sgRNA的5
’
和3
’
端的1至10个碱基。设计好的sgRNA可以通过T7体外转录获得，也可以直接体外合成。
[0016]在一些实施方案中，基因编辑物质还包括用于编辑位点处同源修复的模板dsDNA。同源修复模板dsDNA包括左同源臂DNA、敲入的外源报告基因、右同源臂DNA。模版DNA的左同源臂与DNA切口5
’
端序列同源，右同源臂与DNA切口3
’
端序列同源。
[0017]在一些实施方案中，左右同源臂片段长度可选50至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过在Jurkat细胞中对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将报告基因定点并同框敲入Nur77基因的编码框后，以保证报告基因的表达调控同内源性基因Nur77的表达一致。2.根据权利要求1所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，使用选自ZFN、TALEN或/和CRISPR
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Cas9的基因编辑方法递送基因编辑物质。3.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，基因编辑物质为同源修复模板dsDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。4.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。5.根据权利要求4所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO:1～7中至少一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘平磊，刘达春，张盼，郑勇，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：