鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用，涉及分子生物学技术领域，该分子标志物为位于国际猪参考基因组11.1版本参考序列2号染色体上9380300～9384299bp所在位置的PHEROC基因启动子区域片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。根据核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物组进行猪基因组的PCR扩增，并对扩增产物进行甲基化检测，根据该片段第83位、461位、2473位、3493位、3559位和3685位点的的甲基化情况判断是否存在弱仔猪发生的风险，为母猪产弱仔猪的预防提供有效的检测手段。预防提供有效的检测手段。预防提供有效的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用。

技术介绍

[0002]弱仔的发生是制约畜牧生产健康和养殖效益的重要问题。猪作为一种多胎生哺乳动物，弱仔猪的发生率更是显著。据不完全统计，我国平均每一窝新生仔猪就有1～3头为弱仔猪，其发病率更是占到15％～20％，且弱仔猪在其在生长阶段的营养吸收和脂肪沉积都会受到影响，给我国生猪养殖造成严重的损失。弱仔猪由于其较低的体型和体重，在哺乳阶段处于竞争劣势，不能够获得充足的营养和免疫物质使得其死亡率大大提升。因此，如何预防和治疗弱仔猪成为了养猪行业需要面对的一大难题。它的发生原因十分复杂，虽然研究人员已经做了大量深层次的研究工作，但是其深层发病机制仍然不明确。目前还没有有效的方法可以鉴定是否存在弱仔猪发生的风险。因此，丞需开发出一种有效的可以鉴定弱仔猪发生风险的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用，该分子标志物为位于国际猪参考基因组11.1版本参考序列2号染色体上的PHEROC基因的启动子区域片段，根据该片段的甲基化情况判断弱仔猪的发生，对弱仔猪的预防提供有效的检测手段。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物，该分子标志物为位于国际猪参考基因组11.1版本参考序列2号染色体上9380300～9384299bp所在位置的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；当待测母猪基因组DNA中该序列的第83位、461位、2473位、3493位、3559位和3685位点的甲基化水平升高，表明该待测母猪存在怀有弱仔猪的风险。
[0005]本专利技术还提供了一种扩增上述分子标志物的引物组，该引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条引物。
[0006]本专利技术还提供了一种用于鉴定弱仔猪发生试剂盒，该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条引物。
[0007]本专利技术还提供了一种鉴定弱仔猪发生的检测方法，包含：
[0008]1)提取待测母猪血液的基因组DNA；
[0009]2)针对步骤1)中的基因组DNA构建甲基化文库；
[0010]3)采用如权利要求2中的引物组对步骤2)中构建的甲基化文库进行PCR扩增；
[0011]4)对步骤3)中所得的扩增产物进行碱性磷酸酶处理；
[0012]5)对碱性磷酸酶处理后的扩增产物进行体外转录和RNase酶切；
[0013]6)将所得的酶切产物进行纯化并进行检测，即得甲基化水平结果，当第83位、461
位、2473位、3493位、3559位和3685位点的甲基化水平升高，表明待测母猪存在怀有弱仔猪的风险。
[0014]优选地，上述的检测方法中，其构建甲基化文库包含：在检测合格的基因组DNA中加入腺嘌呤和胞嘧啶均非甲基化的lambda DNA，作为Bisulfite转化率的质量检测，先使用Covaris M220将基因组DNA随即打断至200～400bp；对打断后的DNA片段进行末端修复、加A尾，并连接上所有胞嘧啶均经过甲基化修饰的测序接头；再使用EZ DNAMethylation Gold Kit进行Bisulfite处理，经过处理之后，未发生甲基化的C变成U，PCR扩增后变为T，而甲基化的C则保持不变，最后进行PCR扩增，即得全基因组甲基化测序文库。
[0015]优选地，上述的检测方法中，其PCR扩增采用的仪器为S1000TM Thermal Cycler，采用的试剂盒为PCRAccessory Set。
[0016]优选地，上述的检测方法中，其碱性磷酸酶处理采用的试剂盒为MassCLEAVE Kit。
[0017]优选地，上述的检测方法中，其检测是通过将纯化后的产物点至384孔Specttrp
‑
CHIP的芯片上，将芯片放入MassARRAY Compact System进行检测，其中，Specttrp
‑
CHIP芯片使用MALDI
‑
TOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术进行分析，得到的数据用EpiTYPER软件分析并输出结果。
[0018]本专利技术提供的上述分子标志物或引物组可被用于猪育种中，尤其可用于弱仔猪发生的鉴定。
[0019]本专利技术的一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物、检测方法、引物组及应用，解决了弱仔猪发生的鉴定问题，具有以下优点：
[0020]本专利技术首次提出PHEROC基因启动子区域高甲基化与高发弱仔猪相关，并提供了一组扩增鉴定该启动子区域的扩增引物。
[0021]本专利技术所提供的弱仔猪的诊断分子标志物和用于扩增该分子标志物的引物，能够通过检测被测母猪的血液来检测其基因启动子区域的甲基化水平，并通过甲基化水平反应待检测血液样本对应的猪是否存在怀有弱仔猪的风险，该检测方法具有高效、特异、灵敏的特点，在猪育种中具有潜在的应用价值。
附图说明
[0022]图1为本专利技术中实验组和对照组的分子标记所在位置的甲基化情况对比结果。
具体实施方式
[0023]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实验例1样品收集
[0025]在重庆市荣昌区双河农场所出生的所有荣昌猪仔猪中，选择5头正常体重仔猪(New Body Weight，NBW)和5头弱仔猪即低体重仔猪(Low Body Weight，LBW)，并记录其体重资料和收集血液样本，同时也收集了所有仔猪对应的母猪血液样本。其中，正常体重仔猪对应的母猪为NBW组(对照组)；低体重仔猪对应的母猪为LBW组(实验组)。
[0026]其中，LBW 5例，NBW 5例，在这两组之间无性别差异，出生体重以中位数(最大值、最小值)表示。所有怀孕母猪在妊娠期间均无特殊反应。LBW组除体重显著低于对照组之外，且在刚出生时伴有低体温和呼吸暂停等症状，具体统计数据见下表1。
[0027]表1统计信息
[0028][0029]实验例2甲基化的检测
[0030]1样品DNA提取和检测
[0031]对上述收集的血液样本，使用Blood Genome DNA Extraction Kit(购自Takara公司)提取血液中的DNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书的指示进行操作。对所有提取的DNA使用分光光度计进行质量检测，以DNA浓度高于75ng/μL，总量高于1μg，电泳的主要条带没有明显降解，A260/280的范围在1.7
‑
2.1之间的样品为合格样品。本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定弱仔猪发生的分子标志物，其特征在于，该分子标志物为位于国际猪参考基因组11.1版本参考序列2号染色体上9380300～9384299bp所在位置的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，当待测母猪基因组DNA中该序列的第83位、461位、2473位、3493位、3559位和3685位点的甲基化水平升高，表明该待测母猪存在怀有弱仔猪的风险。2.一种扩增如权利要求1所述分子标志物的引物组，其特征在于，所述引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条引物。3.一种用于鉴定弱仔猪发生试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如权利要求2所述的引物组。4.一种鉴定弱仔猪发生的检测方法，其特征在于，包含：1)提取待测母猪血液的基因组DNA；2)针对步骤1)中的基因组DNA构建甲基化文库；3)采用如权利要求2所述的引物组对步骤2)中构建的甲基化文库进行PCR扩增；4)对步骤3)中所得的扩增产物进行碱性磷酸酶处理；5)对碱性磷酸酶处理后的扩增产物进行体外转录和RNase酶切；6)将所得的酶切产物进行纯化并进行检测，即得甲基化水平结果，当第83位、461位、2473位、3493位、3559位和3685位点的甲基化水平升高，表明待测母猪存在怀有弱仔猪的风险。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)的构建甲基化文库包含：在检测合格的基因组DNA中加入腺嘌呤和胞嘧啶均非甲基化的lambda ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴平先，陈力，姬祥，柴捷，张亮，邱进杰，张利娟，龙熙，张廷焕，郭宗义，王金勇，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：