高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，解决了对红细胞定量的难题，整个待测样本的前处理过程简单，灵敏度高，定量准确，特异性强，7.0分钟之内可同时检测红细胞中5种叶酸及其代谢物，可用于临床上红细胞中5种叶酸及其代谢物的诊断及健康评估。健康评估。健康评估。

【技术实现步骤摘要】
高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法


[0001]本专利技术属于血液检测
，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法。

技术介绍

[0002]叶酸（VB9）是一种不耐热、低密度的水溶性B族维生素，参与核酸、氨基酸、蛋白质及磷脂的代谢，与细胞分化、倍增及其功能密切相关，人体不能合成和转化，必须在食物中获得。育龄妇女适量补充叶酸，可以降低胎儿神经管畸形、21
‑
三体综合征、唇腭裂、心脏病、白血病的发病率，降低孕妇发生流产的可能性。红细胞叶酸是衡量机体叶酸营养状况最常用的指标。叶酸在红细胞中主要以多聚谷氨酸（1
‑
7个谷氨酸）的形式存在，在血浆中γ
‑
谷氨酰水解酶的作用下，向血清中释放活性单谷氨酸形式，因此红细胞叶酸检测能用于评估人体叶酸储备，而将红细胞叶酸多聚谷氨酸形式充分转化成单谷氨酸化合物也成了红细胞叶酸检测的关键。
[0003]黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD，维生素B2在体内的活性形式）、维生素B3（VB3）这两种物质在叶酸代谢通路中也都起到相应的辅助作用，同时测量可以帮助临床更全面的分析叶酸的代谢情况。但是目前能单次同时检测叶酸，FAD和VB3的方法未见文献报道。因此，如果需要同时了解患者红细胞中叶酸、FAD和VB3的量，通常需要对同一份样本进行多次检测，实践上较为繁琐且成本较高。
[0004]目前红细胞叶酸的主要检测手段主要为免疫法、电化学法、荧光法等技术，但是这些方法的特异性较差，目前检测尚未实现标准化，同一份样本使用不同生产厂商的检测系统可能得到不一致的结果。检测结果的巨大差异可能是由于各厂商间使用的校准品及叶酸谷氨酸衍生物检测能力（谷氨酸抗原物质）的不同所造成，而且免疫法也很难实现多种化合物一同测定。高效液相色谱串联质谱法是通过化合物的极性、质荷比及其结构所包含的特征碎片的不同将目标化合物与其干扰成分相互分离，最终实现精准定量的一项技术。相较于免疫法、电化学法、荧光法等技术，高效液相色谱串联质谱法具有更高的灵敏度、精密度和准确度。
[0005]虽然本方法所检测的是维生素类化合物，但和常规血清维生素检测项目有本质差别。使用常规的血清/液相质谱检测方法测定红细胞中的维生素类化合物时，不能充分测得红细胞中各化合物浓度。这是由于红细胞内的物质被细胞与红细胞内的蛋白紧密结合，使用常规的血清前处理方法，红细胞中包含的维生素不能被有效提取出来，导致测定结果比真实值较低。因此，测定红细胞中叶酸及其代谢物时需要采取一定手段充分裂解红细胞，使其中的待测物质被充分释放。
[0006]一些红细胞叶酸文献采用间接测定方法作为直接测定红细胞的替代，分别测定全血和血浆中各化合物的浓度以及红细胞比容（红细胞体积与全血体积的比例，HCT%）来计算出红细胞中的待测物浓度。测定全血的方法实际上与红细胞测定方法近似，都涉及到红细胞的裂解、叶酸多聚谷氨酸的水解以及样品提取等问题，因此并不比直接测定红细胞简单。
而测定全血和血浆实际上测定了两种不同的样品，需要分别进行检测方法的建立和验证，不如直接测定红细胞简便。
[0007]在红细胞的测定中，比较关键的前处理步骤在于叶酸谷氨酰衍生物的解离和样品中待测物质的提取。叶酸谷氨酰衍生物的解离过程通常耗时较长，动辄长达数小时甚至过夜。由于基质复杂，常使用固相萃取小柱，利用合适的洗涤液和洗脱液对样本进行纯化和浓缩。但SPE方法样本溶液纯化所使用的SPE小柱目前市场价格较高，导致单个待测样本的测定成本较高，通常可能占到样本测定成本的一半以上。
[0008]综上所述，目前亟需一种高特异性、高准确度，同时操作简单方便，测定耗时较短，且测定成本较为廉价的红细胞中的叶酸以及FAD、维生素B3的测定方法，以帮助提高叶酸临床检测的质量，并且更全面的分析叶酸的代谢情况。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法。
[0010]本专利技术的技术方案如下：一种高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其中，叶酸及其代谢物分别为：叶酸（VB9）、5
‑
甲基四氢叶酸（5
‑
MTHF）、5
‑
甲酰四氢叶酸（5
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FoTHF）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和维生素B3（VB3）；上述叶酸及其代谢物对应的同位素内标物分别为：叶酸
‑
d4（VB9
‑‑
d4）、5
‑
甲基四氢叶酸
‑
d4（5
‑
MTHF
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d4）、5
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甲酰四氢叶酸
‑
d4（5
‑
FoTHF
‑
d4）、黄素腺嘌呤二核苷酸
‑
d5（FAD
‑
d5）和维生素B3
‑
d4（VB3
‑
d4）；待测样本经前处理后，利用高效液相色谱将目标待测物与样本基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出5种红细胞中叶酸及其代谢物的含量，具体色谱条件为：（1）高效液相色谱条件：流动相A：0.05~0.2% 甲酸
‑
水溶液；流动相B：0.05~0.2% 甲酸
‑
甲醇；色谱柱：Kinetex XB
‑
C18；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0
‑
0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；在0.5
‑
2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在3.0
‑
5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在5.0
‑
5.01分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至70:30；在5.01
‑
7.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；（2）质谱条件：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正离子模式扫描；毛细管电压为3.0kV，喷嘴电压为200 V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为350℃，干燥气流速为10 L/min，鞘气流速为11 L/min，雾化气压力45 psi；同时监测5种红细胞叶酸及其代谢物与对应同位素内标。
[0011]在本专利技术中，待测样本为含EDTA抗凝剂的血液样本经过离心分离去除血浆得到的
红细胞。
[0012]对于本专利技术而言，待测样本的前处理按照如下方法制备：取待测红细胞样本，加入混合内标工作液、保护剂和pH调节剂，涡旋后加入裂解液，避光孵育后，再加入蛋白质沉淀剂，振荡离心后取上清液待进样。
[0013]其中，保护剂为1%~3%VC溶液，可以但不局限于1% VC溶液、1.5% VC溶液、2% VC溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，所述叶酸及其代谢物分别为：叶酸、5
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甲基四氢叶酸、5
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甲酰四氢叶酸、黄素腺嘌呤二核苷酸和维生素B3；上述叶酸及其代谢物对应的同位素内标物分别为：叶酸
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d4、5
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甲基四氢叶酸
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d4、5
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甲酰四氢叶酸
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d4、黄素腺嘌呤二核苷酸
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d5和维生素B3
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d4；待测样本经前处理后，利用高效液相色谱将目标待测物与样本基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出5种红细胞叶酸及其代谢物的含量，具体色谱条件为：（1）高效液相色谱条件：流动相A：0.05~0.2% 甲酸
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水溶液；流动相B：0.05~0.2% 甲酸
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甲醇；色谱柱：Kinetex XB
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C18；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0
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0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；在0.5
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2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在3.0
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5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在5.0
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5.01分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至70:30；在5.01
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7.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为70:30；（2）质谱条件：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正离子模式扫描；毛细管电压为3.0kV，喷嘴电压为200 V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为350℃，干燥气流速为10 L/min，鞘气流速为11 L/min，雾化气压力45 psi；同时监测5种红细胞中叶酸及其代谢物与对应同位素内标。2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，所述待测样本为含EDTA抗凝剂的血液样本经过离心分离去除血浆得到的红细胞。3.根据权利要求2所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，待测样本的前处理按照如下方法制备：取待测红细胞样本，加入混合内标工作液、保护剂和pH调节剂，涡旋后加入裂解液，避光孵育后，再加入蛋白质沉淀剂，振荡离心后取上清液待进样；所述保护剂为1%~3%VC溶液；所述pH调节剂为1M~5M NaOH溶液；所述裂解液为含0.3~1.0 unit/ml谷氨酰水解酶的水溶液；所述蛋白质沉淀剂为体积比为1~4:1的甲醇
‑
乙腈混合溶液。4.根据权利要求3所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，所述保护剂为2%VC溶液；所述pH调节剂为2M~3M NaOH溶液；所述裂解液为含0.4~0.7 unit/ml谷氨酰水解酶的水溶液；所述蛋白质沉淀剂为体积比为体积比为1~2:1的甲醇
‑
乙腈混合溶液。5.根据权利要求4所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，所述pH调节剂为2M NaOH溶液；所述裂解液为含0.5 unit/ml谷氨酰水解酶的水溶液。6.根据权利要求4所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方
法，其特征在于，待测样本的前处理按照如下方法制备：取待测标本红细胞50
ꢀµ
L于1.5 mL EP管中，加入混合内标工作液20
ꢀµ
L，加入2%VC溶液100
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L和2M~3M NaOH溶液10
ꢀµ
L，涡旋5 s，加入10
ꢀµ
L 0.4~0.7 unit/ml谷氨酰水解酶的水溶液，涡旋10s，37℃避光孵育0.5~2 h，加入400
ꢀµ
L液体积比为1~2:1的甲醇
‑
乙腈混合溶液，振荡5 min，在转速为14000~15000 r/min，4℃的条件下离心4~10min，取上清液待进样。7.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法，其特征在于，待测样本的前处理按照如下方法制备：取待测标本红细胞50
ꢀµ
L于1.5 mL EP管中，加入混合内标工作液20
ꢀµ
L，加入2%VC溶液100
ꢀµ
L和2M NaOH溶液10
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L，涡旋5 s，加入10
ꢀµ
L 0.5 unit/ml谷氨酰水解酶的水溶液，涡旋10s，37℃避光孵育1 h，加入400
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L液体积比为2:1的甲醇
‑
乙腈混合溶液，振荡5 min，在转速为14800 r/min，4℃的条件下离心5min，取上清液80
ꢀµ
L待进样。8.根据权利要求3至7中任一项所述的高效液相色谱串联质谱测定红细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李美娟，成晓亮，盛蔚，吴启楠，张伟，
申请(专利权)人：南京品生医疗科技有限公司武汉品生医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：