一种基于LC-MS/MS法同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法技术

一种基于LC

【技术实现步骤摘要】
一种基于LC
‑
MS/MS法同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法


[0001]本专利技术属于药物分析
，具体涉及一种利用LC
‑
MS/MS同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法。

技术介绍

[0002]多粘菌素E是一种由不同的成分组成的复杂混合物，其主要成分是多粘菌素E1(colistin A)和多粘菌素E2(colistin B)。在临床上，多粘菌素E主要用于治疗革兰氏阴性菌感染，抗菌谱主要为不动杆菌属，铜绿假单胞菌，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属等。多粘菌素E由于其肾毒性和神经毒性，在临床上曾一度被弃用。近年来，由于新型抗耐药抗生素的缺乏以及耐药菌的增多，多粘菌素E又一度成为了多重耐药革兰氏阴性菌引起的一系列感染的最后防线。为了减少多粘菌素E的不良反应，提高临床疗效，实现个体化给药和治疗，因此有必要对血清中的多粘菌素E1和E2的浓度进行检测。
[0003]目前国内外对人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的测定方法报道较少，比如文章“Quantification of colistin in plasma by liquid chromatography
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tandem mass spectrometry:Application to a pharmacokinetic study”，报道的该分析方法存在一定的缺陷，最低定量限较高，不适用于临床分析。比如文章“多粘菌素E血药浓度LC
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MS/MS测定方法建立及其药动学研究”，文章中提到的流动相流速为0.65
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2.4mL/min，分析时间长达8min，有机溶剂用量过大。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于LC
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MS/MS法同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，利用液相色谱
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质谱联用(LC
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MS/MS)同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2，该分析方法准确度高，最低检测限低，分析时间短，适宜临床样本的大批量检测。
[0005]为了实现上述的目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0006]一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]1)取系列浓度的多粘菌素E1和多粘菌素E2分别与人空白血清混合，得到样品血清；
[0008]2)对样品血清预处理；
[0009]3)将预处理后的样品血清注入LC
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MS/MS进样分析。
[0010]进一步，所述的样品血清预处理包括以下步骤：
[0011]1)取样品血清与含内标的蛋白沉淀剂，按体积比例为1:2于离心管中混合，涡旋混匀5min，置于4℃离心机以12000rpm转速离心6min；
[0012]2)取出上清液与0.1％甲酸水，按体积比例为1:2混合。
[0013]进一步，所述的含内标的蛋白沉淀剂为蛋白质沉淀剂内加入内标溶液得到的。
[0014]进一步，所述的内标溶液为多粘菌素B110μg/mL的甲醇水溶液，继续用含0.1％甲酸的乙腈稀释成多粘菌素B浓度为1μg/mL的内标工作液。
[0015]进一步，所述的蛋白沉淀剂为含0.1％甲酸的乙腈溶液。
[0016]进一步，所述的含0.1％甲酸的乙腈的蛋白沉淀剂为人空白血清或待测人血清体积的2倍。
[0017]进一步，所述的LC
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MS/MS进样分析采用内标定量法，以多粘菌素E1或多粘菌素E2和内标多粘菌素B1的色谱面积比为纵坐标Y轴，以人血清中多粘菌素E1或多粘菌素E2的浓度为横坐标X轴，建立标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的浓度。
[0018]进一步，所述的建立的标准曲线，多粘菌素E1的代表性标准曲线Y＝0.00126X+0.00854(R＝0.9989)，多粘菌素E2的代表性标准曲线Y＝0.0019X
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0.00572(R＝0.9965)。
[0019]进一步，所述的标准曲线所采用的标品曲线浓度如下：
[0020]多粘菌素E1的七个浓度点依次为：50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL,，1600ng/mL，2000ng/mL；多粘菌素E2的七个浓度点依次为：45ng/mL，90ng/mL，180ng/mL，360ng/mL，720ng/mL，1440ng/mL，1800ng/mL。
[0021]进一步，所述的LC
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MS/MS进样分析采用高效液相色谱，条件如下：流动相A：乙腈；流动相B:含0.1％甲酸水溶液，每个样品采集时间为6min；流速为0.3mL/min，柱温为35℃。
[0022]进一步，所述的高效液相色谱的色谱柱型号：HSS T3色谱柱；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱的方式，0
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0.5min，90％
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90％B；0.5
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2min，90％
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40％B；2
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2.5min，40％
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40％B；2.5
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3min，40％
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10％B；3.0
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4.0min，10％
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10％B；4.0
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4.5min，10％
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90％B；4.5
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6.0min，90％
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90％B。
[0023]进一步，随行质控样品包括最低定量限(LLOQ)，低浓度质控(LQC)，中浓度质控(MQC)和高浓度质控(HQC)。
[0024]进一步，所述的多粘菌素B与多粘菌素E有着相似的化学结构和性质。
[0025]进一步，自动进样器清洗溶液为乙腈，自动进样器清洗模式为进样前和进样后清洗，进样体积为5μL。
[0026]进一步，用于监测人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的药物浓度。
[0027]本专利技术的有益效果是：
[0028]本专利技术建立了一种简便、准确、前处理过程简单的方法来同时测定血清中多粘菌素E1和E2浓度，该方法不仅准确度高，而且最低检测限低，分析时间短，适宜临床样本的大批量检测。该方法已成功应用于TDM，并有助于优化个体给药方案。
附图说明
[0029]图1为本专利技术设计的人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的代表性标准曲线；
[0030]图2为实施例中空白血清的色谱图；
[0031]图3为实施例中LLOQ血清样品中多粘菌素E1和多粘菌素E2以及内标多粘菌素B1的色谱图；
[0032]图4为实施例中待测人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的谷浓度色谱图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取系列浓度的多粘菌素E1和多粘菌素E2分别与人空白血清混合，得到样品血清；2)对样品血清预处理；3)将预处理后的样品血清注入LC
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MS/MS进样分析。2.根据权利要求1所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的样品血清预处理包括以下步骤：1)取样品血清与含内标的蛋白沉淀剂，按体积比例为1:2于离心管中混合，涡旋混匀5min，置于4℃离心机以12000rpm转速离心6min；2)取出上清液与0.1％甲酸水，按体积比例为1:2混合。3.根据权利要求2所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的含内标的蛋白沉淀剂为蛋白质沉淀剂内加入内标溶液得到的。4.根据权利要求3所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的内标溶液为多粘菌素B110μg/mL的甲醇水溶液，继续用含0.1％甲酸的乙腈稀释成多粘菌素B浓度为1μg/mL的内标工作液。5.根据权利要求3所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的蛋白沉淀剂为含0.1％甲酸的乙腈溶液。6.根据权利要求5所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的含0.1％甲酸的乙腈的蛋白沉淀剂为人空白血清或待测人血清体积的2倍。7.根据权利要求1所述的一种基于LC
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MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的LC
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MS/MS进样分析采用内标定量法，以多粘菌素E1或多粘菌素E2和内标多粘菌素B1的色谱面积比为纵坐标Y轴，以人血清中多粘菌素E1或多粘菌素E2的浓度为横坐标X轴，建立标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的浓度。8.根据权利要求1所述的一种基于LC
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MS/M...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨乐，王琴会，任静，郑瑶，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：